miR-34a negatively regulates alveolarization in a bronchopulmonary dysplasia mouse model

Abstract

Bronchopulmonary dysplasia (BPD) is a chronic lung disease of preterm newborns characterized by a simplification of the distal lung structure because of a lack of alveoli formation. The receptor platelet-derived growth factor receptor (PDGFR)alpha, expressed by alpha smooth muscle actin (SMA)+ myofibroblasts, is critical for a proper epithelial-mesenchymal cross-talk required for the formation of alveoli during secondary septation. In BPD, PDGFRalpha is found down regulated but the reason for this is unknown. In a study of mouse lungs exposed to a hyperoxia-based BPD animal model, a microRNA (miR) microarray revealed the up-regulation of miR 34a expression levels. Therefore, the aim was to reduce miR-34a levels in vivo and, for this, an experiment based on a global miR-34a deletion was carried out, resulting in an improvement of the alveolarization and decrease of the septal wall thickness in mice under hyperoxic conditions. As Pdgfra mRNA was found to be a miR-34a target, another experiment blocking the miR 34a Pdgfra interaction by means of TSBs was performed and resulted in an increased total number of alveoli and decreased mean septal wall thickness in mouse lungs under hyperoxic conditions. The same improved lung structure was observed when either miR-34a was deleted specifically in PDGFRalpha+ cells or blocked by an antagomiR-34a (AntmiR34a) in mice under hyperoxic conditions. Regarding the mechanism, miR 34a was expressed in cells located in the developing septa and showed a surprising up regulated miR-34a expression level in PDGFRalpha+ sorted cells from P5.5 newborn mice under hyperoxic conditions. The receptor PDGFRalpha is important for the transdifferentiation of myofibroblasts which are placed in the growing septal tips and producing extracellular matrix (ECM) compounds such as elastin under normal conditions. After blocking miR-34a by AntmiR34a, both PDGFRalpha+ cells and double-positive PDGFRalpha+/alphaSMA+ cells were partially rescued in the BPD animal model assessed by FACS. Additionally, a higher number of alphaSMA+ was observed in the septa together with a better deposition and distribution of elastin revealing a better myofibroblast function. In addition, AntmiR34a administration decreased the level of generalized apoptosis and contributed to a better cell organization in the septa. These data suggested a novel role of miR-34a as a new negative regulator of alveologenesis through Pdgfra in a BPD animal model. Bronchopulmonale Dysplasie (BPD) ist eine chronische Lungenerkrankung frühgeborener Kinder. Ein Hauptmerkmal der BPD ist eine Vereinfachung der distalen Anteile der Lungenstruktur aufgrund einer Fehlbildung der Lungenblässchen, der Alveolen. Der platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) alpha ist wesentlich an der epithelialen-mesenchymalen Interaktion, die für eine korrekte Bildung von Alveolen notwendig ist beteiligt und wird unter anderem in alpha smooth muscle actin (SMA) positiven Myofibroblasten exprimiert. Während der BPD wurde eine Herunterregulation von PDGFRalpha gezeigt. Die zu Grunde liegenden Mechanismen sind derzeit jedoch nicht bekannt.In Studien an postnatalen Mauslungen aus dem Hyperoxie basierten Tiermodel der BPD zeigten microRNA (miR) microarray Analysen eine Hochregulation von miR 34a. Die Zielsetzung dieser Arbeit war die Reduzierung der Expression von miR 34a in vivo und die Analyse der Auswirkung auf die Veränderung der Lungenstruktur im Hyperoxie basierten BPD Model. Diesbezüglich wurde in Mäusen eine globale Gendeletion von miR-34a in vivo durchgeführt. Es zeigte sich eine verbesserte Alveolarisierung und eine Verdünnung der Alveolarsepten unter Deletion von miR 34a in den der Hyperoxie ausgesetzten Mauslungen. Ein Zielgen von miR 34a ist die mRNA von Pdgfra. Um eine spezifische Blockade der Interaktion von miR-34a und der mRNA von Pdgfra zu erzielen, wurde ein target-site blocker in vivo appliziert. Dies führte zu einer Erhöhung der Anzahl der Alveolen und einer Reduzierung der Wanddicke der Alveolarsepten. Gleiche Effekte auf die Anzahl der Alveolen und die Wanddicke der Alveolen wurden durch Deletion von miR-34a in PDGFRalpha-positiven (PDGFRalpha+) Zellen als auch durch die Blockade von miR-34a durch antagomiR-34a (AntmiR34a) Applikation in vivo ausgelöst. Analysen in neu geborenen Mäusen an postnatal Tag (P)5.5 im Hyperoxie basierten BPD Model zeigten, dass miR-34a in Zellen der sich entwickelnden Alveolarsepten lokalisiert ist und in PDGFRalpha+ Zellen, welche an P5.5 isoliert wurden heraufreguliert ist. Der PDGFRalpha ist wesentlich für die Transdifferenzierung von Myofibroblasten. Myofibroblasten befinden sich in den sich entwickelnden Alveolarsepten und bilden extrazelluläre Matrix Komponenten wie beispielsweise Kollagen und Elastin unter physiologischen Bedingungen. Eine Blockade von miR-34a durch AntmiR34a im Hyperoxie basierten BPD Model zeigte in FACS Analysen eine teilweise Aufhebung der Reduzierung sowohl der PDGFRalpha+ Zellen als auch der PDGFRalpha+ und alphaSMA+ doppelpositiven Zellen in den der Hypoxie ausgesetzten Mäusen. Darüber hinaus zeigten sich mehr alphaSMA+ Zellen in den Alveolarsepten, sowie eine besser organisierte Ablagerung und Verteilung von Elastin als Zeichen einer verbesserten Funktion der Myofibroblasten. Zudem zeigte sich der Grad der allgemeinen Apoptose vermindert und führte zu einer verbesserten Organisation der Alveolarsepten. Diese Ergebnisse deuten auf eine neue Rolle von miR-34a als negativer Regulierer der Bildung von Alveolarsepten über PDGFRalpha im Hyperoxie basierten Tiermodel der BPD hin.