Der therapeutische Effekt von Dendriten und Tumorzell-Fusions-Hybriden auf das Tumorwachstum der akuten myeloischen Leukämie

Abstract

Ziel dieser Arbeit war die Evaluation von Immunantworten als Reaktion auf eine Stimulation durch Hybride aus dendritischen Zellen und AML-Zellen.Zur Fusion wurde eine Kombination aus Polyethylenglycol- und Elektroporationsfusion verwendet. Die Bestimmung des Phänotyps der stabilen Hybridzellen zeigte eine Expression von MHC-Klasse II-Molekülen, den DZ-Markern CD209 und PKH-26, den AML-Markern CD13 und PKH-67 und den kostimulatorischen Molekülen CD40, CD58, CD80 und CD83. Kontinuierlich konnten wir das CBFß/MYH11-Fusionsproduktes in den Hybriden mit inv(16)-positiven AML-Zellen mittels Western blots nachweisen. Die Aktivierungsfähigkeit der Hybridzellen auf T-Lymphozyten wurde in Proliferationstests untersucht und durchflusszytometrisch ausgewertet. Die Analysen zeigten, dass Fusionshybride generiert aus inv(16)-Abnormität tragenden AML-Blasten und autologen dendritischen Zellen einen Proliferationsreiz für autologe T-Lymphozyten bieten. Fusionshybride mit inv(16)-negativen AML-Blasten bieten keinen signifikanten proliferativen Anreiz für autologe T-Lymphozyten. Die in vitro erarbeiteten Ergebnisse führten zu einem Heilungsversuch. Die 59 jährige-Patientin mit nachgewiesener inv(16)-positiver AML-Erkrankung erlitt trotz wiederholter verschiedener Chemotherapiezyklen und Rezidivchemotherapie immer wieder einen Rückfall der Erkrankung. Bei fehlendem KM-Spender, intensiver Aufklärung sowie Einverständnis durch die Patientin wurden s.c. Vakzinierungen, mit bestrahlten Fusionszellen bestehend aus autologen dendritischen Zellen und AML-Blasten ohne Adjuvans konsolidierend durchgeführt. Um nachzuweisen, dass die Vakzinierung mit HZ zu einer AML-Zellen-spezifischen Immunantwort führt, wurden in vitro Analysen mit aus Knochenmark gewonnenen T-Zellen sowohl vor als auch nach Vakzinierung durchgeführt. Wir konnten zeigen, dass der durch eine Vakzinierung ausgelöste Effekt eng mit der Dosierung und der Frequenz der Vakzinierung assoziiert ist. Durch niederfrequente, niedrig dosierte Vakzinierung wurde eine unspezifische Immunstimulation erreicht. Durch hochfrequente, hochdosierte Vakzinierungen konnte eine spezifische, lang anhaltende CD8-positive Immunantwort gegen autologe AML-Zellen in vitro ausgelöst werden. Unsere Auffindungen suggerieren, dass das Fusionsprodukt CBFß/MYH11 ein neoantigenes Merkmal bereitstellt, das MHC-Molekül Klasse-I restringiert eine Aktivierung von CD8-positiven T-Lymphozyten nach sich zieht. Aim of this work has been to evaluate the answer induced by elicitation of the immune system with hybrid cells derived from dentritic and AML cells.Cell fusion has been conducted using a combination of polyethylene glycole and electroporation methods. Phenotype determination of stable hybrid cells showed expression of MHC classe II molecules, DZ-markers CD209 and PKH-26, AML-markers CD13 and PKH-67 as well as the co-stimulating molecules CD40, CD58, CD80 and CD83. We were able to trace the CBFß/MYH11 fusion product within the hybrids with inv(16)-positive AML cells by western blots continously. The hybrid cell´s ability to activate T lymphocytes was examined by proliferation tests and plotted by flow cytometry. Analyses revealed a proliferation stimulus for autologic T lymphocytes by fusion hybrids generated from inv(16)anomalousness carrying AML blasts and autologic dendritic cells. Fusion hybrids with inv(16)-negative AML blasts showed no significant proliferation stimulus for autologic T lymphocytes. Assessment of results from the in vitro experiments indicated a cure treatment. A patient of 59 years with confirmed inv(16)-positive AML disease suffered from ever repeating relapse of the disease despite repeated, different chemotherapy cycles and relapse chemotherapy. Without a matching bm donor, after comprehensive information and consent given by the patient, consolidating s.c. vaccinations with irradiated fusion cells from autologic dentritic cells and AML blasts without adjuvans were applied. To account for specific AML cell immune reaction to the vaccination with hybrid cells, in vitro analyses were conducted with T cells of bone marrow before and after vaccination. We showed an association of the elicited effect closely related with dosage and frequency of the vaccination. A low frequent, low dosage vaccination yielded an unspecific effect, while a high frequeny, high dosage vaccination led to a specific and longly lasting CD8-positive immune reaction against autologic AML cells in vitro. Our findings suggest that the fusion product CBFß/MYH11 provides a neo-antigenic feature, which restrings the MHC molecule class I and initiates activation of CD8-positive T lymphocytes.