The extracellular matrix in bronchopulmonary dysplasia : the role of the lysyl oxidase family

Abstract

Extracellular matrix (ECM) formation and remodeling play a central role in the processes of lung alveolarization and secondary septation. A key component of ECM structure is a complex collagen and elastin network of fibers. Formation and maintenance of this crucial structure is perturbed in aberrant lung development in patients with bronchopulmonary dysplasia (BPD) as well as in experimental animal models of BPD. Lysyl oxidases comprise a family of five members, which facilitate the covalent cross-linking of collagen and elastin molecules, thus controlling ECM structural homeostasis. Moreover, alternative non-matrix gene regulatory roles for these enzymes have been proposed. Recently, lysyl oxidases have been implicated in the pathogenesis of various lung diseases, including cancer, fibrosis, pulmonary hypertension and BPD. Although several studies report perturbations to lysyl oxidase expression, and elastin and collagen deposition associated with the arrest of alveolarization in BPD, a causal role for lysyl oxidases in this processes has not yet been fully addressed. In the study presented here, lysyl oxidase activity was neutralized in vivo in a murine hyperoxia-based model of BPD. In addition, non-matrix roles for three of the five family members, Lox, Loxl1 and Loxl2 were explored on the primary mouse fibroblasts background. In the first part of the study, an arrest in alveolarization in developing mouse lungs was induced by hyperoxia exposure. Damage to alveolar formation was accompanied by an increase in lysyl oxidase activity, and an increase in the abundance of collagen and collagen cross-links. In contrast, the abundance of the insoluble elastin and elastin cross-links desmosine and isodesmosine was decreased, resulting in a substantial shift in collagen-toelastin ratio. Normalization of lysyl oxidase catalytic activity partially restored normal levels of collagen. The abundance of elastin cross-links and the formation of elastin foci was also improved. However, no significant improvement in lung alveolarization was observed. In the second part of the study, a microarray analysis after small interfering (si)RNA knockdown in primary mouse lung fibroblasts revealed a dysregulation of expression of a large group of genes, including several ECM-relevant players, such as Mmp3, Mmp9, Rarres1 or Eln. Moreover, the expression patterns of these genes in an in vivo animal model of BPD correlated with observations made in vitro. Importantly, the gene regulatory roles of lysyl oxidases were independent of lysyl oxidase catalytic activity. Die Entstehung und Umwandlung von extrazellulärer Matrix (EZM) spielt eine zentrale Rolle bei der Lungenalveolarisierung und der sekundären Septierung. Die Schlüsselkomponente der EZM Struktur ist ein komplexes Netzwerk aus Kollagen- und Elastinfibrillen. Die Entstehung und Aufrechterhaltung dieser wichtigen Strukturen ist bei Patienten, die an bronchopulmonaler Dysplasie (BPD) leiden, genauso wie in tierexperimentellen Modellen von BPD, im Sinne einer gestörten Lungenentwicklung, verändert. Lysyloxidasen sind eine Enzymfamilie, die aus fünf Mitgliedern besteht und für die Kontrolle der strukturellen Homöostase der EZM zuständig sind, indem sie die kovalente Quervernetzung von Kollagen- und Elastinmolekülen übernehmen. Zudem wurden weitere nicht-EZM bezogene genregulatorische Funktionen dieser Enzyme vermutet. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass Lysyloxidasen eine Rolle in der Pathogenese verschiedener Lungenerkrankungen, einschließlich Tumorerkrankungen, Fibrose, pulmonale Hypertonie und BPD, spielen. Obwohl verschiedene Studien von der Veränderung der Lysyloxidasenexpression und der veränderten Einlagerung von Kollagen und Elastin im Zusammenhang mit dem Alveolarisierungsstopp bei BPD berichten, wurde die kausale Rolle der Lysyloxidasen in diesen Prozessen bisher nicht untersucht.In der hier vorgestellten Studie, wurde die Aktivität der Lysyloxidase in vivo in einem Hyperoxie basierten Mausmodell der BPD ausgeschaltet. Außerdem wurde die nicht Matrix bezogene Rolle von drei der fünf Familienmitglieder Lox, Loxl1 und Loxl2 in primären Mausfibroblasten untersucht.Im ersten Teil der Studie wurde der Alveolarisierungsstopp in sich entwickelnden Mauslungen durch Hyperoxie Exposition ausgelöst. Der Schaden an der alveolären Formation wurde von einer gesteigerten Lysyloxidasenaktivität begleitet, genauso wie von einer erhöhten Kollagenmenge und vermehrten Kollagenquervernetzungen. Im Gegensatz dazu, waren der Überschuss von unlöslichem Elastin und die Anzahl der Elastinquervernetzungen mit Desmosin und Isodesmosin verringert, was in einer deutlichen Veränderung des Kollagen/Elastin-Verhältnisses resultierte. Die Ausschaltung der enzymatischen Aktivität der Lysyloxidase konnte die Kollagenmenge immerhin teilweise normalisieren. Ebenso verbesserten sich die Zahl der Elastinquervernetzungen und die Entstehung der Elastinfoci. Dennoch konnte kein förderlicher Effekt auf dieLungenalveolarisierung beobachtet werden. Im zweiten Teil der Studie zeigte eine Microarray Analyse nach Ausschaltung der Enzyme durch small interfering (si)RNAs in primären murinen Lungenfibroblasten die Dysregulation einer großen Gruppe von Genen, inklusive einiger EZM-relevanter Gene, wie Mmp3, Mmp9, Rarres1 oder Eln. Zudem korrelierten die Expressionsmuster dieser Gene in vitro mit Daten aus einem in vivo Modell der BPD. Interessanterweise waren diese genregulatorischen Eigenschaften der Lysyloxidasen unabhängig von ihrer katalytischen Aktivität.