Functional characterization of peroxisomes in the heart and the role of Pex11a and Pex14 in cardiomyocytes

Abstract

Peroxisomen sind ubiquitäre Zellorganellen, die ihre Hauptfunktion im Stoffwechsel von Lipid und reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) ausführen. Peroxisomen spielen eine sehr wichtige Rolle in der Erhaltung der Lipidhomöostase innerhalb der Zelle und der Verhinderung von Krankheitsprozessen.Die Wichtigkeit der normalen peroxisomalen Funktionen und deren wichtige Bedeutung bei ihrem Funktionsausfall werden in vielen Zellweger-Syndrom Patienten und Mausmodellen deutlich. Da Patienten mit Zellweger-Syndrom eine extrem kurze Lebenserwartung haben, wurden kardiologische Symptome der Patienten bisher nicht als Todesursache beobachtet und berichtet. Bei leichteren Phenotypen von peroxisomalen Erkrankungen, z.B. adulte Refsum-Symdrom-Patienten, sind jedoch klare Zeichen der kardialen Dysfunktion deutlich präsent.Die am Anfang der Doktorarbeit durchgeführte Datenbanksuche bestätigte bereits die Expression vieler peroxisomaler Gene im Herzen von der C57BL/6J-Mäusen. Weiterhin, zeigten die Ergebnisse dieser Thesis, dass die peroxisomalen Enzymaktivitäten und Expressionen unterschiedlich waren zwischen Herz und Leber, und dass die Verteilung und Anzahl der Peroxisomen in Vorhöfen und Herzkammern voreinander abweichend waren. In den Herzkammern, war der Gehalt der peroxisomalen mRNAs und Proteine deutlich höher als in den Vorhöfen. Die postnatale Entwicklung und Reifung des Herzens wurde begleitet von einer deutlichen Veränderung der Peroxisomenmarker. In der Tat, könnten somit peroxisomale Gene als mögliche Krankheitsmarker geeignet sein. Nach Ischämie-Reperfusion des Herzens, wurde eine starke Reduzierung an Pex11a; und eine Erhöhung des Pex14 Gens beobachtet, was darauf hindeutet, dass Peroxisomen in Ischämie-Reperfusionsschäden involviert sein könnten.Mit Hilfe eines Pex11a; Gen-Knockout Mausmodells, das von unserer Arbeitsgruppe mit-etabliert wurde (Li, et al., 2002), wurde nachgewiesen, dass Pex11a; Gendefekt im Herzen, nicht nur dramatische Störungen der peroxisomalen Gene verursachen konnten, sondern auch zur Veränderungen in Mitochondrien und von endoplasmischen Reticulum Markern führen konnten. Trotz des vorhandenen deutlichen molekularen Phänotyps, wurden unter normalen Bedingungen jedoch kein makroskopischer Phänotyp und keine Änderungen von morphologischen Parametern festgestellt. Obwohl die kardialen Marker in Pex11a; Knockout Kardiomyozyten verändert waren, wurde das Kontraktionsverhalten der Kardiomyozyten nicht beeinflusst. Dagegen, waren die Herzen von Pex11a; knockout Mäusen nicht so resistent gegen Ischämie-Reperfusionsschäden, was darauf hindeutet, dass Peroxisomen und das Pex11a; Gen eine wichtige Rolle bei der Protektion der Herzfunktion im Rahmen der Ischämie-Reperfusionsschädungsprozesse spielen könnten.Zusätzlich wurden Zellkulturstudien an HL-1 Kardiomyozyten durchgeführt, die eine vergleichbare peroxisomale Gene Expression wie Kardiomyozyten im Mausvorhof aufweisen. Weiterhin wurde durch Transfektion von HL-1-Zellen mit Pex14 siRNA ein knockdown Modell des Pex14-Gens zur Nachahmung eines Zellweger-Syndroms in Zellkultur etabliert. Zu den Pex14-defizierten Zellen konnten eine veränderte kardiale Markerexpression, erhöhte mitochondriale Marker sowie eine Hemmung der Proliferation der Zellen beobachtet werden.In Rahmen der vorgelegte Doktorarbeit konnten folgende Erkenntnisse erzielt werden: Peroxisomen sind reichlich in der Linkskammer vorhandeln und unterstützten die normale Herzfunktion. Im Fall eines peroxisomales Gendefekts, kommt es zu Störungen der Homöostase des Herzens. Die prophylaktische oder therapeutische Peroxisominduktion könnte sich deshalb bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen, z.B. Ischämie-Reperfusionsschäden, positiv auswirken. Peroxisomes are ubiquitous organelles hosting a wide range of essential metabolic enzymes involved in lipid metabolism and free radical detoxification. Therefore these organelles maintain homeostasis in the intracellular environment and protect against disease. The importance of normal peroxisomal function, and the link between dysfunction and disease development, is demonstrated by patients with Zellweger syndrome and corresponding mouse models. Due to the extremely short lifespan of Zellweger patients and the severe neurological phenotype, the cardiac symptoms are not reported as the cause of the mortality. However, in less severe peroxisome-related diseases, as seen in patients suffering from adult Refsum disease, the heart deficiency is clearly manifested.In the work described in this thesis, initial data mining confirmed the expression of many peroxisomal genes in the heart, and we experimentally confirmed that peroxisomal gene expression differed between the heart and liver, with corresponding changes in protein abundance and enzyme activity. Furthermore, we found that the number of peroxisomes, and the gene and protein expression profiles, differed among the four chambers of the heart. The abundance of peroxisomal mRNAs and proteins was higher in the ventricles than the atria. Postnatal development and maturation of the heart was accompanied by marked changes in the abundance of peroxisomal markers, suggesting that such markers could be used to monitor cardiac development and maturation and possibly also to diagnose cardiac diseases. Accordingly, following ischemia-reperfusion, Pex11a; gene expression was suppressed and the abundance of PEX14p increased, confirming that these markers are affected by ischemia-reperfusion injury.Using a general Pex11a; knockout mouse, we found that the loss of this gene induced a clear molecular phenotype involving the dysregulation of peroxisome-related genes as well as changes in mitochondrial and endoplasmic reticulum markers in the heart. However, no macroscopic phenotype was observed and there were no obvious changes in the morphology of cardiomyocytes under normal conditions. Interestingly, cardiomyocytes from the hearts of Pex11a; knockout mice showed no impairment of contractile function under control conditions even though cardiac markers were affected. However, the hearts of Pex11a; knockout mice were less resistant to ischemia-reperfusion injury, suggesting that Pex11a; and peroxisomes have a protective role during the ischemia-reperfusion process.Finally, we established a knockdown model of peroxisome deficiency in HL-1 cells. These cells contain many peroxisomes with an appropriate enzyme composition. The knockdown of the peroxisomal biogenesis gene Pex14 by RNAi caused the disruption of cardiac markers, the induction of mitochondrial markers and the inhibition of cell proliferation.In conclusion, the data presented in this thesis demonstrate that the peroxisomal compartment is most abundant in the left ventricle and is closely associated with and supportive of normal heart functions. When peroxisomes are depleted or deficient in cardiomyocytes, there is a severe disruption of cardiomyocyte homeostasis. Protective and therapeutic strategies using peroxisome-related genes as targets may therefore help to prevent cardiac dysfunction caused, for example, by ischemia reperfusion injury, thus maintaining the healthy function of the heart.