The role of hypoxic signaling in evasive tumor resistance against anti-angiogenic therapy

Abstract

Rapidly growing tumors depend on supply of oxygen and nutrients and avascular neoplastic lesions do not grow larger than 1-2 mm in diameter. At a very early stage of tumor growth, a phenotypic shift occurs, referred to as angiogenic switch , during which hypoxia induces secretion of angiogenic factors by tumor cells driving the formation of new vessels, which is a critical milestone in tumor progression. Realization of this key feature of tumor biology led Judah Folkman in the 1970s to propose a novel therapeutic approach anti-angiogenic therapy, the rationale for which was based on blocking the growth of tumor vessels. At that time, it was believed that since tumor cells were not the primary target, no resistance mechanisms would be encountered. Yet, after the first clinical trials, it became obvious that tumors could indeed adapt to the therapy. One of the resistance mechanisms, which is the primary focus of the current thesis, is characterized by increased invasion and metastasis, preventing wider application of anti-angiogenic agents for the treatment of various carcinomas.Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT), a process characterized by specific changes in epithelial cells leading to weakening of cell-to-cell contacts and increased motility, has been shown to regulate tumor cell migration and metastatic dissemination. Since hypoxia is a well characterized trigger of EMT, we hypothesized that enhanced tumor hypoxia generated by anti-angiogenic therapy could be the driver of this form of resistance. To explore this hypothesis, several in vivo models of treatment with anti-angiogenic drugs (sunitinib, sorafenib, or bevacizumab) were established, which revealed increased metastasis following therapy. Next, using human lung and breast cancer lines re-isolated from tumors of animals receiving antiangiogenic therapy with sunitinib, we could show that these cells acquire a stable EMT-phenotype with invasive and metastatic traits. Importantly, the cells isolated from tumors of animals receiving anti-angiogenic therapy were more responsive to hypoxia, showing increased levels of hypoxia inducible factor 2 alpha (HIF2alpha). We could further show that prolonged exposure to intermittent hypoxia is sufficient to induce an EMT phenotype in tumor cells. Moreover, loss of function experiments identified HIF2alpha as a factor required for maintenance and acquisition of the EMT phenotype. Finally, we identified DNA demethylation mediated by the Ten-Eleven Translocation 1 (TET1) methylcytosine dioxygenase as a mechanism by which intermittent hypoxia upregulates HIF2alpha expression.Taken together, our findings provide insight into the mechanisms underlying evasive resistance of tumors to anti-angiogenic therapy. In particular, we show that intermittent hypoxia induces a feed-forward loop involving HIF2alpha and TET1 which leads to epigenetic reprogramming of tumor cells promoting enhanced tumor response to hypoxia and increased invasion and metastasis. This work may contribute to a more rational approach to anti-angiogenic therapy, specifically combining anti-angiogenic and HIF2alpha-targeting approaches, which could potentially decrease the risk of tumor metastasis, and thus improve the clinical outcome of anti-angiogenic treatment. Schnell wachsende Tumore sind auf die Versorgung mit Sauerstoff sowie Nährstoffen angewiesen, so dass avaskuläre Tumore nicht größer als 1-2mm in Durchmesser werden können. In dieser Phase des Tumorwachstums findet eine angiogene Umstellung statt, bei der Hypoxie die Sekretion von angiogene Faktoren induziert, welche die Bildung neuer Blutgefäße fördern. Dies stellt einen essentiellen Schritt in der Tumorprogression dar und führte zur Entwicklung von anti-angiogenen Therapien in der Tumorbehandlung. Bei diesen von Judah Folkmann entdeckten Therapien sollte eine Gefäßbildung in Tumoren blockiert werden. Da bei einem solchen Therapiekonzept die Tumorzellen nicht direkt angegriffen werden, erwartete man, dass keine Resistenzbildung stattfinden würde. Dennoch wurde in ersten klinischen Studien schnell klar, dass sich Tumore der Therapie anpassen konnten. Einer dieser Resistenzmechanismen, der den Hauptfokus dieser Dissertation darstellt, zeichnet sich durch verstärkte Invasion und Metastasenbildung aus, was die Anwendung anti-angiogener Therapien bei vielen Karzinomen erschwert.Die epitheliale-mechenchymale Transition (EMT) ist ein Prozess, der durch spezifische Veränderungen des Phänotyps der Epithelzellen, einer Schwächung der Zell-Zell-Kontakte und erhöhter Motilität gekennzeichnet ist. Zudem ist er auch an der Regulation der Tumorzellmigration und des Metastasenausbreitung beteiligt. Ein bekannter Auslöser der EMT ist Hypoxie. Unsere Hypothese war es daher, dass die durch anti-angiogene Therapie verstärkte Hypoxie, den Auslöser dieser Form der Resistenz darstellt. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden mehrere in vivo Studien mit anti-angiogenen Substanzen (Sunitinib, Sorafenib oder Bevacizumab) durchgeführt, in denen wir eine verstärkte Metastasenbildung nach anti-angiogener Therapie nachweisen konnten. Als nächstes wurden humane Lungen- sowie Brustkrebszelllinien aus Tumoren von Mäuse isoliert, die mit anti-angiogenetischen Therapien behandelt wurden. Wir konnten zeigen, dass diese einen stabilen Phänotyp angenommen hatten, der sich durch erhöhten EMT und Invasivität auszeichnete. Zusätzlich zeigten diese Zellen keine Anzeichen der klassischen Resistenzbildung, zeichneten sich aber stattdessen durch eine verstärkte Hypoxieantwort aus (mit höherer Expression vom Hypoxie-induzierten Faktor 2alpha, HIF2alpha). Weiterhin konnten wir in einem in vitro Modell zeigen, dass eine prolongierte Inkubation der Tumorzellen unter einer intermittierenden Hypoxie (IH) ausreichend war, um den EMT-Phänotypen auszulösen. Des Weiteren konnten wir zeigen mit Hilfe von funktionellen genetischen Experimenten, dass HIF2alpha essentiell für die Entstehung, sowie für den Erhalt dieses Phänotyps war. Abschließend identifizierten wir eine, von TET1-methylcytosin-dioxygenase vermittelte DNA-Demethylierung als einen entscheidenden Faktor für die durch intermittierende Hypoxie ausgelöste, verstärkte Expression von HIF2alpha.Zusammenfassend zeigt diese Arbeit einen grundliegenden Mechanismus bezüglich der Resistenzentwicklung von Tumoren gegenüber anti-angiogener Therapien. Wir konnten zeigen, dass intermittierende Hypoxie über einen Mechanismus der positiven Rückkopplung, der sowohl HIF2alpha als auch TET1 beinhaltet zu einer verstärkte Hypoxieantwort mit erhöhter Metastasenbildung führt. Diese Arbeit könnte zu neuen Ansätzen in der Anwendung anti-angiogener Therapien führen. Durch Kombination von HIF2 und TET1-Inhibtioren könnte das Risiko der Metastasenbidung durch anti-angiogenen Therapien effektiv verringert werden, was die Wirksamkeit der Behandlung verbessern könnte.