Die Wirkung von Endotoxin auf die Ansprache auf Strahlentherapie im nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom

Abstract

Pneumonien sind häufige Komplikationen bei Patienten mit NSCLC. Hierbei findet man meist gram-negative Erreger, deren Virulenz in erster Linie durch die Zellwandkomponenten, besonders durch gram-negatives Lipopolysacharid (LPS), definiert wird. Das Auftreten von Pneumonien bedingt eine schlechtere Prognose und Therapieansprache im NSCLC. Die Strahlentherapie stellt einen integralen Bestandteil in der Therapie des NSCLC dar. Daher wurde in dieser Dissertation untersucht, inwieweit LPS die Ansprache auf eine Strahlentherapie verändert. Drei humane NSCLC Zelllinien, A549 (Adenokarzinom), H23 (Adenokarzinom) und H226 (Plattenepithelkarzinom) wurden mit steigenden Konzentrationen von LPS inkubiert und das zelluläre Überleben mittels drei unterschiedlicher Methoden untersucht. Anhand des klonogenen Überlebens (Koloniebildungstest) und direkter Zellzählung wurde das Überleben nativer und mit einer Strahlendosis von 2 und 6 Gy behandelter Zellen direkt quantifiziert. Indirekt wurde das zelluläre Überleben anhand des MTS-Assays untersucht, welches die Stoffwechselaktivität der Zellen misst. Zur Veranschaulichung der Ergebnisse wurde die Überlebensfraktion berechnet, welche das prozentuale Verhältnis von bestrahlten zu unbestrahlten Zellen ausdrückt.Der Vergleich der unbehandelten Zelllinien hinsichtlich ihres Verhaltens nach Radiatio im Koloniebildungstest erbrachte, dass die Adenokarzinomzelllinie A549 die strahlenresistenteste war, während die Adenokarzinomzelllinie H23 die höchste Strahlensensitivität aufwies. Die Plattenepithelkarzinomlinie H226 zeigte diesbezüglich ein intermediäres Verhalten.Verglichen mit dem Goldstandard, dem Koloniebildungstest, erwies sich die direkte Zellzählung ebenfalls als geeignet, um eine Strahlensensitivität darzustellen und lieferte vergleichbare Ergebnisse mit einer tendenziell höheren Überlebensfraktion, was vermutlich methodisch bedingt ist. Da sich die Stoffwechselaktivität nach Radiatio nicht änderte, war der MTS-Assay nicht geeignet um im aktuellen experimentellen Aufbau die Strahlensensitivität der einzelnen Zelllinien zu untersuchen.Eine alleinige Stimulation aller drei unbestrahlten Zellinien mit Endotoxin (0,1, 1 und 10 ug/ml) induzierte keinen messbaren Anstieg des klonogenen Überlebens.Im Koloniebildungstest zeigte sich bei der Adenokarzinomzelllinie A549 sowohl im Niedrigdosisbereich von 2 Gy als auch unter Bestrahlung mit 6 Gy 10 µg/ml Endotoxin als effizienteste Dosis zur Induktion einer Strahlenresistenz. An der Zelllinie H23 konnte selbiges Ergebnis aufgezeigt werden, an der Zelllinie H226 trat eine statistisch signifikante Hemmung der Strahlensensibilität jedoch unter einer Konzentration von 0,1 µg/ml LPS auf.Bis auf die hoch strahlensensible Zelllinie H23, die nach Bestrahlung mit 6 Gy lediglich ein Überleben von etwa 2-3% der Zellen aufwies, konnte stets im Niedrigdosis- (2Gy) als auch im Hochdosisbereich (6Gy) eine Strahlenresistenz durch LPS induziert werden. Die direkte Zellzählung erbrachte vergleichbare Ergebnisse hinsichtlich der Ausprägung der LPS-induzierten Strahlenresistenz an den Zelllinien A549 und H23, nicht jedoch an der Zelllinie H226. Allerdings war das Niveau der detektierten Strahlensensibilität bei dieser Methode geringer. Zusammenfassend induzierte die LPS-Behandlung an nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomzellen eine Abnahme der Strahlentherapieansprache. So könnten bakterielle Infekte eine Therapieresistenz im Lungenkarzinom begünstigen. Mögliche zugrundeliegende Mechanismen könnten beispielsweise in der Stimulation der Cyclooxygenase und Freisetzung von Prostanoiden, der Aktivierung des EGFR-Systems oder in der Induktion von CREB oder ERK begründet sein. Die hier vorgelegte Arbeit bildet diesbezüglich die Grundlage hinsichtlich der Wahl der geeigneten Methoden und Zelllinien sowie LPS-Konzentrationen und Bestrahlungsdosen für weiterführende Untersuchungen. Pulmonary infections are frequent complications in patients with NSCLC. The majority of infections is caused by gram-negative germs, with Lipopolysaccharides defining their pathogenicity. The incidence of pneumonia is inversively correlated with prognosis and therapy response of NSCLC. Irradiation is one therapeutic backbone of NSCLC in both curative and palliative settings. Against this background, the effect of LPS on therapy response to irradiation was investigated.For that purpose, three human non-small-cell lung cancer (NSCLC) cell lines, A549 (adenocarcinoma), H23 (adenocarcinoma) and H226 (squamous cell carcinoma) were incubated with different concentrations of LPS. Cellular Survival was quantified by three different methods: We investigated clonogenic survival (Colony Assay) of native and irradiated cells (2 Gy and 6 Gy). Moreover, survival was quantified directly by automatic cell counting and indirectly by quantifying the metabolic activity by MTS Assay. Cellular survival was calculated by the rate of surviving cells after irradiation compared to native cells (Surviving Fraction).Radiotherapy induced a significant reduction in clonogenic survival in all cell lines, with the most resistant cell line being A549 followed by H226 and finally H23, as the most radiosensitive line when comparing the cell lines as to their radiosensitivity When comparing the methods applied to quantify radiosensitivity, it was shown that besides the colonly formation assay as the goldstandard for quantifying radiosensitivity - direct cell counting was equally appropriate and generated comparable results; however, the surviving fraction tended to be higher than that measured by colony formation assay due to methodical differences. As metabolic activity of irradiated cells remained unchanged after irradiation, the MTS Assay was found not to be adequate to quantify cellular survival after irradiation.Treatment with LPS did not affect the clonogenic survival of non-radiated cells, but reduced radiosensitivity in all three cells lines after radiotherapy. Whereas in the A549 and H23 cell lines 10 µg/ml was the most efficient endotoxin concentration to induce radioresistance at radiation doses of 2 and 6 Gy, a significant reduction of radiosensitivity in H226 cells was already observed under LPS concentration of 0,1 µl/ml. Except for the primarily high radiosensitive cells line H23, displaying a cellular survival of as less as 2-3% when performing colony formation assays after irradiation with 6 Gy, treatment with LPS induced radioresistance in all cell lines as well upon irradiation with 2 Gy or 6 Gy. This LPS-induced radioresistance could be reproduced by automatic cell counting in means of quantity; albeit the effect of irradiation was lower when directly counting cells.In conclusion, LPS induced a decreased sensitivity of NSCLC cell lines towards radiotherapy. These results suggest that the bacterial infections may be actively involved in the progression of lung cancer by inducing radiotherapy resistance. Possible underlying mechanisms could be the activation of the stimulation of cyclooxygenase and the release of prostanoids, EGFR activation or the upregulation of signaling events like ERK and CREB-activation. This thesis provides a valuable basis as to the selection of adequate methods and cell lines, as well as irradiation- and LPS-doses for further research in this field.