Interaktion des Hepatitis C Virus mit zellulären Faktoren

Abstract

Das Hepatitis-C-Virus (HCV) ist wie alle Viren auf zelluläre Interaktionspartner angewiesen, von denen jedoch noch nicht alle identifiziert oder näher charakterisiert sind. Um mehr zum heutigen Erkenntnisstand beizutragen und neue Therapieansätze zu entwickeln, ist die weitere Erforschung der HCV-Wirt-Interaktion unabdingbar. HCV gehört zu den membranumhüllten Flaviviridae, die ein einzelsträngiges Plus-Strang RNA-Genom besitzen. Eine Anlagerung der leberspezifischen microRNA-122 (miR-122) an mindestens fünf hoch konservierte Bindungsstellen im HCV-Genom ist von immenser Bedeutung für die Replikation, Translation und Stabilisierung der RNA. Das Virus befällt Hepatozyten, wobei die chronische Infektion oft zu Leberzirrhosen und hepatozellulären Karzinomen (HCC) führt. Obwohl es gut wirksame Medikamente gibt, ist aufgrund der hohen genetischen Varianz keine Impfung möglich. Zudem bilden sich vermehrt Resistenzen aus, und die bereits entstandenen Leberschäden sowie einige stoffwechselbedingte Änderungen in den Zellen bleiben auch nach erfolgreicher Elimination des Virus bestehen. Im Rahmen dieser Arbeit sollten zunächst die drei hoch konservierten miR-122Bindungsstellen in der NS5B-codierenden Region (5B.2 und 5B.3) und der 3´UTR (S3), welche bislang kaum beschrieben wurden, näher untersucht werden. Es zeigte sich in Mutationsstudien, dass die Anlagerung der miR-122 an die Bindungsstelle 5B.2 einen positiven Effekt auf die virale Replikation auswirkt. Die Bindung an 5B.3 wies einen schwächeren und an S3 keinen signifikanten Effekt auf. Insgesamt spielt die miR-122 eine sehr komplexe Rolle in der Regulation des HCV-Replikationszykluses. Hauptaugenmerk dieser Thesis war die Analyse des Einflusses einer HCV-Infektion auf das zelluläre Transkriptom und Translatom mit Hilfe des Ribosome Profiling. Diese Methode ermöglicht die Detektion von Veränderungen der zellulären Genexpression zu einem bestimmten Zeitpunkt. Die Ergebnisse machten deutlich, dass die virale Replikation zu keiner allumfassenden Veränderung der zellulären Genexpression führt. Nur wenige Gene waren signifikant differenziell exprimiert. Diese Gene stehen vor allem im Zusammenhang mit dem Endoplasmatischen Retikulum (ER)-Stress, der Beeinflussung von Signalwegen, der HCV-Replikation und der Karzinogenese. Transkriptionell herunter reguliert waren interessanter Weise Untereinheiten von Komplexen der mitochondrialen Atmungskette, was möglicherweise zu einer oft in Krebszellen beobachteten metabolischen Umprogrammierung (Warburg Effekt) der Hepatozyten führt. Viruses like the Hepatitis-C-Virus (HCV) depend on cellular interaction partners, but not all of these factors are identified or characterized in detail. Therefore, studying HCV- host-interaction is required to understand underlying mechanisms and to develop new therapeutic approaches. HCV belongs to the family of Flaviviridae and has a positive-sense single-stranded RNA genome. Five highly conserved microRNA-122 (miR-122) target sides located on the viral RNA are involved in enhancing replication, translation, and stability of the genome. HCV preferentially infects human hepatocytes, often leading to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). Although powerful direct-acting antivirals (DAAs) are available, there is no efficient vaccine due to rapid emergence of virus quasispecies. Furthermore, liver diseases and metabolic changes recur with a very high incidence even after successful clearance of HCV.In this research the three highly conserved miR-122 target sides in the NS5B coding region (5B.2 and 5B.3) and in the 3´UTR (S3) of the HCV RNA were supposed to be analyzed. In full-length genomes, mutations in the miR-122 target sites revealed that 5B.2 is positively involved in regulating overall genome replication efficiency. Mutation of 5B.3 showed a weaker and S3 no significant effect. Thus, the miR-122 target sites are involved in a complex interplay in regulating the HCV replication cycle.Focus of this work was the investigation of transcriptome and translatome changes due to an HCV-infection with Ribosome Profiling. This method produces a snapshot of actively translating ribosomes in a cell. We found that established viral replication does not cause global changes in host gene expression. Only few genes are significantly differentially expressed. These genes are mainly related to ER stress, interference with signaling pathways, HCV replication and cancer development. Transcriptional downregulation mainly affects mitochondrial respiratory chain complex core subunit genes, which could contribute to cancer cell-like metabolic reprogramming, called Warburg effect.