Charakterisierung der Expression und Aktivität von Ras-Isoformen in humanen Lungenkarzinomzellen mit onkogenem K-Ras 4B und Modulation der Zellmotilität

Abstract

Ras-Proteine gehören zur Familie der kleinen GTP-bindenden Proteine, die als molekulare Schalter in der Zelle eine zentrale Rolle einnehmen. Eine aktivierende Mutation von K-Ras findet sich in etwa 30 % der humanen Adenokarzinome der Lunge. In dieser Arbeit wurde die Expression, Aktivität und Wachstumsfaktor-vermittelte Aktivierbarkeit von K-Ras im Vergleich zu den beiden Ras-Isoformen H-Ras und N-Ras in Lungenkarzinomzellen untersucht und der Einfluss von K-Ras auf das Migrationsverhalten analysiert. Hierfür wurden humane Lungenade- nokarzinomzelllinien mit aktiverender K-Ras-Mutation (A427, A549, H358, HCC44) und ohne Mutation (Colo699) untersucht. Als Vergleich diente die Pankreaskarzinomzelllinie Panc1 mit aktivierender K-Ras Mutation. Das Vorliegen aller Ras-Isoformen konnte im Immunblot in jeder untersuchten Zelllinien bestätigt werden. Als am stärksten exprimierte Isoform konnte K-Ras identifiziert werden, gefolgt von N-Ras und H-Ras. In Ras-GTP-Bindungsassays wurde gezeigt, dass K-Ras auch den größten Anteil des aktiven Ras in allen untersuchten Zelllinien repräsen- tiert. Durch Stimulation mit epidermal growth factor (EGF) konnten alle Ras-Isoformen aktiviert werden, am stärksten nahm die Aktivität von N-Ras zu. K-Ras ließ sich in Zellen mit Wildtyp K-Ras (Colo699) oder heterozygoter K-Ras-Mutation (A427, H358, HCC44) stimulieren, in Zellen mit homozygoter K-Ras-Mutation (A549) konnte keine weitere Aktivierung erzielt werden. Zur Charakterisierung des Migrationsverhaltens der Zellen wurden Wounding Assays, bei denen die Dauer bis zum Verschluss einer in einen konfluenten Zellrasen gesetzten Wunde gemessen wird, durchgeführt. Hier zeigte sich eine große Heterogenität zwischen den Zellinien bei der benötigten Zeit bis zum Wundverschluss. Durch EGF-Stimulation konnte ein beschleunigter Verschluss des Wundspalts beobachtet werden, wobei die Zunahme der Verschlussgeschwin- digkeit mit einer Steigerung zwischen 7,9 % - 97,9 % im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle sehr unterschiedlich ausfiel. Eine Ras-Blockade mit Farnesyltransferase-Inhibitor FTI-227, den K-Ras-Inhibitoren Fendiline bzw. FTS führte zur Verlangsamung der Zellmigration. Durch Be- handlung der Zellen mit Ras-Inhibitor und Stimulation mit EGF konnte der inhibitorische Effekt von FTI-227 und Fendiline revertiert werden. Bei FTS, welches auch die stärkste Verlangsamung der Migration hervorrief, konnte der inhibitorische Effekt durch Stimulation mit EGF nicht kompensiert werden. In der vorliegenden Arbeit konnte die Verteilung und unterschiedliche Aktivierbarkeit der Ras-Isoformen durch EGF sowie die Relevanz von K-Ras für die Migration in Lungenadenokarzinomzellinien gezeigt werden. Ras proteins belong to a family of small GTP-binding proteins, which play a central role as molecular switches in the cell. Approximately 30 % of all human adenocarcinomas of the lung carry an activating mutation of K-Ras. In the present study the expression, activity and growth factor-mediated activation of K-Ras in lung adenocarcinoma cells was compared to those of Ras isoforms H-Ras and N-Ras. We further analyzed the influence of K-Ras on migratory behavior of these cells. For this purpose, human lung adenocarcinoma cell lines with active K-Ras mutation (A427, A549, H358, HCC44) and without mutation (Colo699) were investigated. The well characterized pancreatic carcinoma cell line Panc1 with activating K-Ras mutation was used for comparison. The presence of all Ras isoforms was confirmed in each cell line by immunoblot procedure. K-Ras was identified as the primarily expressed isoform, followed by N-Ras and H-Ras. In Ras-GTP binding assays it was shown that K-Ras also represents the largest portion of active Ras in all cell lines studied. Stimulation with epidermal growth factor (EGF) lead to activation of all Ras isoforms, with N-Ras activity increasing the most. K-Ras was stimulated in cells with wild-type K-Ras (Colo699) or heterozygous K-Ras mutation (A427, H358, HCC44) whereas no activation was observed in cells with homozygous K-Ras mutation (A549). To characterize the migratiory behavior of the cells, wounding assays were performed in which the duration until closure of a wound placed in a confluent cell layer was measured. Here, a great heterogeneity between the cell lines in the time period to close the wound was observed. EGF stimulation resulted in an accelerated closure of the wound gap in all cells, with an increase in the closure rate between 7.9 % and 97.9 % compared to the unstimulated control. A Ras blockade with the farnesyltransferase inhibitor FTI-227 or one of the K-Ras inhibitors Fendiline and FTS decreased cell migration. By treating the cells with Ras inhibitor and co-stimulation with EGF, the inhibitory effects of FTI-227 and Fendiline could be reverted. However, the inhibitory effect of FTS, which also caused the strongest slowdown in migration, could not be compensated by stimulation with EGF. In the present work, the distribution, activity and different activation of the Ras isoforms by EGF as well as the relevance of K-Ras in migration of lung adenocarcinoma cell lines were demonstrated.