Die Effizienz der Cas9 Endonuklease für die DNA-Doppelstrangbruchinduktion in vitro

Abstract

Hochspezifische Nukleasen sind potente genome editing tools mit deren Hilfe gezielt Doppelstrangbrüche verursacht werden können. Unter den verschiedenen Nukleasen erlaubt das CRISPR-Cas System eine vergleichsweise einfache und schnelle Programmierung . Damit die Endonuklease gezielt einen Doppelstrangbruch verursachen kann, muss das Enzym einen Komplex mit der guide RNA, einer 20 bp langen Nukleotidsequenz, bilden. Durch die Auswahl der guide RNA kann nahezu jeder Abschnitt der DNA adressiert werden. Ziel der Arbeit ist es herauszufinden, inwiefern die Informationen aus den Experimenten in zellfreien Reaktionssystemen Voraussagen über die Aktivität der Cas9 Endonuklease mit verschiedenen guide RNAs in der Zellkultur erlauben.Für die zellfreien Experimente musste guide RNA generiert und das Cas9 Protein exprimiert und aufgereinigt werden. Für die Versuche in der Zellkultur wurden zwei verschiedene guide RNA in den px330 Vektor kloniert, welcher zusätzlich auch das Gen für Cas9 enthielt. Dieser Vektor wurde zusammen mit einem Traffic light Reporter System (TLR) in eine HEK293 Zelllinie kotransfiziert. Das TLR System diente zur Erfassung der Aktivität und beinhaltet inaktive Fluoreszenzgene. Nach einem Doppelstrangbruch kam es durch Non homologous end joining (NHEJ) zu einem frameshift, wodurch das Fluoreszenzgen exprimiert wurde. Nach der Transfektion wurde mittels Westernblot die Expression von Cas9 in den Zellen nachgewiesen und mit Immunfluoreszenz-Aufnahmen die Translokation des Proteins in den Zellkern dargestellt. Die Aktivität wurde qualitativ mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie und quantitativ mittels FACS Analysen überprüft.In den zellfreien Experimenten konnte erst bei einem 30-fachen Überschuss des Enzyms eine Nicking-Aktivität festgestellt werden, obwohl Doppelstrangbrüche des Vektorsubstrats erwartet wurden. Die Expression und Translokation des Cas9 Enzyms in den Zellkern konnte bewiesen werden. Insgesamt wurden Aktivitätstests für vier verschiedene targets (Cas9 T1- T4) durchgeführt. Einzig Cas9 T3 überragte mit 30 % Aktivität signifikant die anderen targets, welche keine Aktivität aufwiesen. Die Auswahl der geeigneten targets nimmt eine zentrale Rolle in der Versuchsplanung ein und beeinflusst das outcome entscheidend. Die Ergebnisse der zellfreien Versuche erlauben keine Rückschlüsse darauf, ob die gewählte guide RNA zusammen mit dem Cas9 Protein in den Zellkultur-Versuchen effizient sind. Highly specific endonucleases are potent genome editing tools which can provide specific double strand breaks. Among various endonucleases the CRISPR Cas system allows an easy and fast way of programming. In order to cause a double strand break the enzyme needs to form a complex with a guide RNA, which consists of a 20 bp long nucleotide sequence. It is possible to address nearly every locus of the DNA with selection of guide RNA. Purpose of this thesis is to ascertain, wether one can draw inferences from cell-free experiments about the activity of Cas9 endonucleases with different guide RNA in vitro.Generation of guide RNA and expression of Cas9 enzymes were necessary in order to perform cell-free experiments. Two different guide RNA were cloned into px330 vector, which also contained the gene for Cas9 endonuclease. A HEK293 cell line was cotransfected with this vector and a traffic light reporter system (TLR). The TLR system conduced to track the activity and contained two inactive fluorescence genes. If a break undergoes non homologous end joining (NHEJ) there will be a frameshift and the fluorescence gene will be rendered in frame and expressed. Western Blots were made to prove the expression of Cas9 in cells. Translocation of the proteins to nucleus were shown with immunofluorescence. The activity was verified qualitatively via fluorescence microscopy and quantitatively via FACS analyses.Although double strand breaks were expected, a 30x excess of the enzyme was necessary to demonstrate nicking activity in cell free experiments. The expression and translocation of Cas9 enzymes to nucleus were demonstrated. Activity tests were performed with 4 different targets (Cas9 T1-T4). Only T3 topped significantly all other targets with 30 % activity. Other tested targets showed no signifcant activity. The selection of eligible targets plays an important role in experimental designs and affects the outcome crucially. No conclusions can be drawn from the results of cell free experiments; it remains unclear whether the selected guide RNA and the Cas9 protein will be effcient in cell culture experiments.