Charakterisierung des E-Cadherin-Adhäsionskomplexes und der Einfluss von Rho-GTPasen in Lungenkarzinomzellen

Abstract

Durch die Ausbildung von Adhäsionskontakten werden Zellen dazu befähigt sich aneinanderzulagern. Eine Funktionseinheit der Adhäsionskontakte ist der E-Cadherin-Catenin-Komplex. In Tumorzellen liegen die Adhäsionskontakte häufig in veränderter Ausprägung vor, was den Tumorzellen ermöglicht sich aus dem Gewebsverbund zu lösen und zu migrieren. In der vorliegenden Arbeit wurde der E-Cadherin-Adhäsionskomplex in verschiedenen Lungenkarzinomzellen analysiert und der Einfluss der kleinen Rho-GTPasen RhoA und RhoC auf den E-Cadherin-Adhäsionskomplex untersucht. Die neun verschiedenen Lungenkarzinomzelllinien HTB-55, H2122, H23, A427, A549, Colo 699, H358, SCLC-21H und H1688 zeigten unterschiedliche Cadherinexpressionsmuster. Hierbei korreliert die E-Cadherinproteinmenge zum Teil mit den Differenzierungsgraden der Lungentumorzellen. Cadherin-11 und P-Cadherin scheinen aufgrund ihrer geringeren Expression in den Lungenkarzinomzellen eher eine untergeordnete Rolle zu spielen. Die analysierten Catenine alpha-, beta-, gamma und p120ctn ließen sich in allen Lungenkarzinomzellen in unterschiedlichen Mengen nachweisen. Die höchsten Proteinmengen wurden in den Zelllinien A549, H358 und HTB-55 detektiert, welche ebenfalls die höchsten Proteinmengen an E-Cadherin aufwiesen. Durchgeführte Immunpräzipitationen konnten die direkte bzw. indirekte Bindung zwischen E-Cadherin, beta-, alpha- und p120ctn nachweisen und somit das Vorliegen des E-Cadherin-Adhäsionskomplexes in den Zelllinien A549, H358 und H23 bestätigen. Per Immunfluoreszenz konnte gezeigt werden, dass der E-Cadherin-Adhäsionskomplex vorwiegend an der Membran benachbarter Zellen vorkommt. In der Zelllinie H23 scheint die E-Cadherin vermittelte Zellädhäsion aufgrund der geringen Konzentration des präzipitierten E-Cadherin-Catenin-Komplexes eher gering ausgeprägt.Um den Einfluss der kleinen Rho-GTPasen auf den E-Cadherin-Adhäsionskomplex zu untersuchen, wurden die Zellinien H358, H23 und A549 transient mit pEGFP Plasmid- DNA transfiziert um eine Überexpression von RhoA und RhoC zu erzielen. Durchgeführte Proteinanalysen zeigten in den Zelllinien H23 und A549 eine Erhöhung der Pro- teinmengen von E-Cadherin und beta-Catenin sowie eine vermehrte Bildung des E-Cadherin-Adhäsionskomplexes in A549-Zellen. Insgesamt konnte in dieser Arbeit ein ähnlicher Effekt von RhoA und RhoC auf E-Cadherin und beta-Catenin sowie den Adhäsionskomplex in den analysierten Lungenkarzinomzellen nachgewiesen werden, welcher in einer Erhöhung oder gleichbleibenden Proteinmenge von E-Cadherin und beta-Catenin und einer Stabilisierung des E-Cadherin vermittelten Adhäsionskomplexes resultierte. The formation of adhesion junctions enables cells to be attached to each other. One functional unit of the adhesion junctions is the E-cadherin-catenin complex. In tumor cells there is often an altered or reduced amount of adhesion junctions, which allows cells to detach from the tissue and migrate. In the present study the E-cadherin adhesion complex was examinated in different lung carcinoma cells and the influence of the small Rho GTPases RhoA and RhoC on the E-cadherin adhesion complex was analyzed. The nine different lung carcinoma cell lines HTB-55, H2122, H23, A427, A549, Colo699, H358, SCLC-21H and H1688 showed different expression patterns of cadherins. The amount of E-cadherin correlates in part with the degrees of differentiation of the lung tumor cells. Cadherin-11 and P-cadherin showed a low expression in lung carcinoma cells and seemed to play a minor role in the cells. The analyzed catenins alpha-, beta-, gamma- and p120ctn were detected with different amounts in all lung carcinoma cells, whereby the largest amounts of protein were detected in the cell lines A549, H358 and HTB-55, which also had the largest amounts of E-cadherin. Immunoprecipitations were performed to detect the direct or indirect binding between E-cadherin, beta-, alpha- and p120ctn and showed the presence of the E-cadherin adhesion complex in the cell lines A549, H358 and H23. Immunofluorescences studies revealed a membrane localisation of the E-cadherin-mediated adhesion complex especially in areas of cell-cell contacts.To analyze the influence of the small Rho GTPases on the E-cadherin adhesion complex, the cell lines H358, H23 and A549 were transiently transfected to achieve overexpression of RhoA and RhoC. Protein analyzes showed in the tranfected cell lines H23 and A549 an increase in the protein levels of E-cadherin and beta-catenin as well as an increase in the E-cadherin adhesion complexes in A549 cells. Taken together a similar effect of RhoA and RhoC on E-cadherin and beta-catenin as well as the adhesion complex was established in the analyzed lung carcinoma cells. The overexpression of Rho GTPases resulted in an increase or equal level of E-cadherin and beta-catenin and the stabilizati- on of the E-cadherin-mediated adhesion complex.