Non-invasive, pränatale Bestimmung fetaler Blutgruppenmerkmale an Thrombozyten (HPA-Merkmale) aus mütterlichem Plasma mittels Next-Generation-Sequencing (NGS)

Abstract

Hintergrund: Die fetale/neonatale Alloimmunthrombozytopenie (FNAIT) beruht auf einer fetomaternalen Inkompatibilität der humanen Plättchenantigene (HPA-Merkmale). Die Mutter bildet thrombozytäre Alloantikörper gegen fetale, vom Vater vererbte Antigene, welche, nach Transport über die Plazenta in die fetale Zirkulation, eine fetale/neonatale Thrombozytopenie auslösen können. Die schwerwiegendste Komplikation stellt die intrakranielle Blutung des Fetus dar. Eine Genotypisierung der fetalen HPA-Merkmale ist notwendig, wenn der Vater für das implizierte Merkmal heterozygot ist, um festzustellen, ob der Fetus das Risikoallel trägt und ob prophylaktische, pränatale Interventionen, wie die maternale Gabe von i.v. Immunglobulin, erforderlich sind. Die bisher beschriebenen Verfahren zur pränatalen, nicht-invasiven Genotypisierung fetaler humaner Plättchenantigene verzichten auf eine interne Kontrolle für das Vorhandensein fetaler DNA in der Plasmaprobe. Patientinnen/Proband/-innen und Methoden: Zunächst erfolgte eine Validierung der nicht-invasiven, fetalen RHD-Bestimmung aus zellfreiem, maternalem Plasma mittels Real-time-PCR. Hierzu wurden Blutproben von 23 gesunden, nicht-schwangeren Blutspender/-innen sowie von 29 RhD-negativen Schwangeren, welche bei der Blutentnahme kurz vor einer elektiven Sectio Caesarea standen, untersucht. Zur Etablierung des nicht-invasiven Nachweises fetaler HPA-Merkmale mittels massiv-paralleler Sequenzierung (Next-Generation-Sequencing) wurde von 13 Schwangeren (5 Fälle mit vorbekannter FNAIT) und 3 gesunden, nicht-schwangeren Blutspender/-innen zellfreie DNA aus dem Plasma isoliert. Die Blutentnahme der Schwangeren erfolgte im Median in der 30. Schwangerschaftswoche (Spannweite: 14. - 41. SSW). Mit Gen-spezifischen Primerpaaren wurden die Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs) ITGB3 (HPA-1), ITGA2B (HPA-3), ITGA2 (HPA-5), sowie CD109 (HPA-15) gezielt amplifiziert und mittels Next-Generation-Sequencing (Halbleitertechnologie) sequenziert. Als interne Positivkontrolle sowie zur Bestimmung der fetalen DNA-Fraktion dienten folgende SNPs bzw. Exonsequenzen: RHD, RHCE, KEL, DARC, SLC14A1, GYPA, GYPB, SLC4A1, Y-chromosomale Sequenzen sowie 8 (Primer Panel I (PP I)) bzw. 14 (Primer Panel II (PP II)) autosomale, anonyme Polymorphismen. Ergebnisse: Real-time-PCR: Alle RhD-positiven Feten (n=15) wurden erfolgreich detektiert. Bei den Plasmaproben von Schwangeren mit bestätigten RhD-negativen Feten (n=10) wurde in 7 von 10 Fällen das Nichtvorliegen einer fetomaternalen RhD-Inkompatibilität richtig erkannt. In den anderen drei Fällen war das Ergebnis nach vorab definierten Kriterien indeterminiert. Vier Plasmaproben wurden aufgrund einer Verunreinigung exkludiert. Next-Generation-Sequencing: 15 von 19 vorliegenden fetomaternalen HPA-Inkompatibilitäten wurden erfolgreich detektiert, bei den anderen vier Fällen lag der Anteil paternaler, fetaler Allele unter dem vorab definiertem Schwellenwert von 2 %. Bei dem Nichtvorliegen einer fetomaternalen HPA-Inkompatibilität (n=33) erfolgte in allen Fällen, bis auf eine Ausnahme, richtig negativ keine Detektion des antithetischen Allels. Weitere non-maternale Sequenzen (neben den HPA-Merkmalen), welche als interne Kontrolle für das Vorhandensein fetaler DNA dienten, konnten bei Plasmaproben von 12 Schwangeren nachgewiesen werden. Die Gesamtanzahl der detektierten Reads betrug pro Zielregion im Durchschnitt 5624 (Mittelwert; SD: 3090, Spannweite: 585 - 14453, n=153; PP I), bzw. 2720 (Mittelwert; SD: 1842, Spannweite: 321 - 11666, n=325; PP II). Fetale DNA wurde im Median an 3 Loci (Spannweite: 1 - 8; PP I; 6 Schwangere) bzw. an 7,5 Loci (Spannweite: 1 - 10; PP II, 12 Schwangere) detektiert. Die durchschnittliche Konzentration der fraktionalen, fetalen DNA in maternalem Plasma betrug 8,00 % (Mittelwert; Spannweite: 4,49 % - 15,90 %; PP I), bzw. 13,65 % (Mittelwert; Spannweite: 4,35 % - 29,87 %; PP II). Diskussion: Die gezielte massiv-parallele Sequenzierung ist ein valides Verfahren zur nicht-invasiven, pränatalen Genotypisierung fetaler humaner Plättchenantigene aus maternalem, zellfreiem Plasma. Falsch negative Testergebnisse werden durch die Sequenzierung weiterer Polymorphismen sowie durch die Bestimmung der fetalen, fraktionalen DNA-Konzentration verhindert. Durch die Etablierung der neuen Methode wurde die Möglichkeit geschaffen, auch andere fetale Blutgruppenmerkmale, welche Zielstruktur maternaler Antikörper bei der hämolytischen Erkrankung des Fetus und Neugeborenen sind, pränatal und nicht-invasiv zu bestimmen. Background:Fetal and neonatal alloimmune thrombocytopenia (FNAIT) results from fetomaternal incompatibility of human platelet antigens (HPA). The mother produces alloantibodies against paternally inherited fetal antigens present on fetal platelets. After transplacental transport, these alloantibodies can cause thrombocytopenia in the fetus or newborn. The most devastating consequence is intracranial hemorrhage of the fetus. Consequently, genotyping of HPA is required if the father is heterozygous for the implicated alloantigen to determine whether the fetus is at risk and whether prophylactic prenatal interventions, such as maternal IVIG therapy, are needed. However, previous published methods for prenatal, noninvasive genotyping of fetal human platelet antigens do lack an internal control to verify the presence of fetal DNA in the plasma sample.Patients/Subjects and Methods:First, noninvasive fetal genotyping of RHD via real-time PCR of cell-free DNA isolated from maternal plasma was validated. For this purpose, blood samples from 23 healthy, non-pregnant blood donors and 29 RhD-negative pregnant women were analysed. The blood was taken shortly before an elective caesarean section. To demonstrate the feasibility of noninvasive fetal genotyping of human platelet antigens using massively parallel sequencing (Next-Generation-Sequencing), cell-free DNA was isolated from the plasma of 13 pregnant women (5 with a history of FNAIT) and 3 healthy, non-pregnant blood donors. The median gestational age at the time of blood sampling was 30 weeks (range 14 - 41). Gen-specific primer pairs were used to amplify following single-nucleotide polymorphisms (SNPs): ITGB3 (HPA-1), ITGA2B (HPA-3), ITGA2 (HPA-5), and CD109 (HPA-15). These SNPs were massively parallel sequenced using a semiconductor device. As an internal positive control as well as to determine the fetal DNA fraction we also sequenced RHD, RHCE, KEL, DARC, SLC14A1, GYPA, GYPB, SLC4A1, Y chromosome-specific sequences as well as 8 (Primer Panel I (PP I)) and 14 (Primer Panel II (PP II)) anonymous polymorphisms respectively.Results:Real-time PCR: All RhD-positive fetuses (n=15) were successfully detected. In 7 out of 10 cases the absence of a fetomaternal incompatibility of rhesus D was correctly identified (10 women carried a RhD-negative child), in the remaining three cases the results were inconclusive by predefined criteria. Four plasma samples were excluded due to contamination.Next-Generation-Sequencing: 15 out of 19 existing HPA-incompatibilities were successfully detected, in the remaining four cases the number of sequence reads of the paternally inherited fetal alleles was below the cutoff value of 2%. In case of the absence of a fetomaternal HPA-incompatibility (n=33), the number of base calls for the antithetical allel was correctly below the detection limit in all cases but one. Further non-maternal sequences (other than HPA), serving as an internal control to verify the presence of fetal DNA, could be determined in plasma samples from 12 pregnant women. We obtained a mean of 5,624 sequence reads (SD: 3,090, range: 585 - 14,453, n=153; PP I) and 2,720 sequence reads (SD: 1,842, range: 321 - 11,666, n=325; PP II) per target respectively. Sequences of fetal origin were detected at a median of 3 loci (range: 1 - 8; PP I; 6 pregnant women) and 7,5 loci (range: 1 - 10; PP II; 12 pregnant women) respectively. The mean fractional fetal DNA concentration in cell-free maternal plasma was 8.00% (range, 4.49% - 15.90%; PP I) and 13.65% (range, 4.35% - 29.87%; PP II) respectively.Discussion:Massively parallel sequencing is a valid method for noninvasive, prenatal genotyping of fetal human platelet antigens using cell-free maternal plasma. Furthermore, false negative results are prevented due to the inclusion of additional polymorphic loci and the determination of the fetal fractional DNA concentration. By establishing this new method, we paved the way for noninvasive, prenatal genotyping of other fetal blood group polymorphisms frequently involved in hemolytic diseases of the fetus and newborn.