Der Einfluss von Polyelektrolytkomplex-Nanopartikel-Beschichtung auf die osteogene Differenzierung in vitro

Abstract

Die Versorgung von Frakturen mit Osteosynthesematerial und der erfolgreiche Einsatz von Implantaten stellt vor dem Hintergrund systemischer Knochenerkrankungen, insbesondere der Osteoporose, eine Herausforderung dar. Gerade in einer zunehmend älteren Gesellschaft ist eine steigende Inzidenz von Frakturen zu erwarten. Nicht zuletzt bedeuten durch Osteoporose bedingte Knochenbrüche eine gesamtgesellschaftliche ökonomische Belastung und für die Betroffenen oftmals eine dauerhafte Einschränkung ihrer Lebensqualität. Die Verbesserung der Materialeigenschaften von Implantat- und Osteosynthesematerialien ist ein Ansatz, um den Behandlungserfolg weiter zu verbessern. In dieser Arbeit wurden Polyelektrolytkomplex-Nanopartikel, welche mit dem zur Behandlung der Osteoporose zugelssenen Wirkstoff Risedronat beladen wurden, hinsichtlich ihrer Eignung als funktionalisierende Beschichtung für Titanoberflächen evaluiert.Anhand von Kulturen mesenchymaler Stromazellen aus Bohrmehlproben jeweils fünf knochengesunder und osteoporotischer Individuen verschiedenen Alters und Geschlechts wurde der Einfluss der Testmaterialien auf die osteogene Differenzierung, Lebensdauer und Funktion von Zellen der osteogenen Reihe untersucht. Gerade diese Zellen sind von Interesse, da eine gegenüber der Knochenresorption zu geringe Knochenformierung durch Osteoblasten und eine gesteigerte Apoptose von Osteozyten zu pathologischem Knochenschwund führen.Auf Platten aus einer für Knochenersatzmaterialien entwickelten Titan-Niob Legierung mit einer Beschichtung aus risedronathaltigen Polyelektrolytkomplex-Nanopartikeln wurden mesenchymale Stromazellen kultiviert. Nach Zugabe von osteogenem Differenzierungsmedium wurde zu verschiedenen Zeitpunkten die Zellvitalität, der Erfolg der osteogenen Differenzierung sowie das Ausmaß der Mineralisierung extrazellulärer Matrix für das oben beschriebene Material im Vergleich zu Platten mit einer Beschichtung aus direkt aufgebrachtem Risedronat und unbeladenen Nanopartikeln, mit unbeschichteten Platten sowie mit materialfreien Zellkulturen bestimmt. Hierfür wurden MTT-Zellvitalitätsassays und mikroskopische Lebendzellbeobachtungen durchgeführt, die Kalzium- und Osteokalzinkonzentration im Überstand gemessen, die Aktivität der alkalischen Phosphatase in Bezug auf das Gesamtprotein im Zellysat bestimmt sowie extrazelluläre Kalziumablagerungen mit Alizarinrot S Farbstoff gefärbt und quantifiziert.Risedronat wirkte unter Verwendung größerer Mengen von 2,5 × 10-7 mol bereits zu Beginn der Versuchszeit toxisch auf die Zellkulturen. Dies wurde früh mikroskopisch sowie am Ende der einmonatigen Versuchszeit anhand des Vitalitätsassays und der durch Kalziummessungen nachvollzogenen Mineralisierung sichtbar. Die Wirkung des Medikaments wurde dabei durch eine Applikation über die Polyelektrolytkomplex- Nanopartikelbeschichtung verstärkt und trat insbesondere im knochengesunden Kollektiv zum Vorschein. Die wirkstofffreie Polyelektrolytkomplex-Nanopartikelbeschichtung selbst hatte hierbei zu keinem Zeitpunkt einen toxischen Einfluss.Nach starker Verringerung der Risedronatmenge auf 2,5 × 10-11 mol in einen Bereich, in welchem protektive Effekte auf Osteoblasten erwartet werden, konnten bei starker individueller Abweichung einzelner Zellkulturen voneinander keine Auswirkungen des Wirkstoffes nachgewiesen werden. Ein signifikanter Anstieg an Kalziumablagerungen unter Verwendung wirkstofffreier Titan-Niob-Platten blieb für Kombinationen mit selbst geringen Risedronatmengen jedoch aus.Einen beobachteten Abfall der Osteokalzinkonzentration im Überstand gegen Ende der Versuchszeit gilt es weiter zu untersuchen.Insgesamt zeigten Polyelektrolytkomplex-Nanopartikel als adhärente Beschichtung eine uneingeschränkte Biokompatibilität mit mesenchymalen Stromazellen im Verlauf ihrer osteogenen Differenzierung. Zudem setzten sie ihren Wirkstoff effektiv frei. Vorbehaltich einer weiter verbesserten Freisetzungskinetik und Bestätigung osteoprotektiver Effekte in nanomolaren Konzentrationsbereichen wären risedronathaltige Polyelektrolytkomplex-Nanopartikel zur lokalen Funktionalisierung von Titanoberflächen vielversprechend und könnten Nebenwirkungen einer systemischen Risedronattherapie an Implantaten vermeiden helfen. Even today, the successful treatment of bone fractures or joint replacement using implant materials poses a great challenge under osteoporotic conditions. Further improvement of implant material properties is needed considering the rising number of fractures caused by population aging in most societies. The functionalization of material surfaces is one approach to ease the immense costs and individual suffering of unsuccessful therapy for frail patients. Hence, this study investigated the suitability of polyelectrolyte complex nanoparticles containing the bone therapeutic risedronate as an interfacial drug delivery system, by evaluating its biocompatibility and influence on mesenchymal bone cells, also known as stromal cells. The differentiation of osteogenic precursor cells found in mesenchymal stromal cell cultures and prevention of osteoblast apoptosis are important therapeutic targets to preserve bone formation.Cultures of reaming debris derived mesenchymal stromal cells representing five bone healthy and five osteoporotic donors were seeded on test materials. The test materials consisted of Titan-Niob alloy discs that were coated with risedronate loaded polyelectrolyte complex nanoparticles. Comparisons were made between the test material and the untreated disc as well as coatings of drug-free particles or dried risedronate solution, and material free cultures. After differentiation along the osteogenic lineage, the successful differentiation, cell viability and osteogenic function were evaluated. For this purpose MTT-cell viability assays, microscopic examination, soluble calcium and osteocalcin marker-protein quantification, alkaline phosphatase kinetics and Alizarinred S staining of calcium deposits were performed.Higher levels (2,5 × 10-7 mol) of incorporated risedronate showed toxic effects visible under the microscope as early as day one and lead to decreased cell viability and mineralization 35 days later. Drug released from particles had a greater impact compared to dried risedronate coatings. Differences were more notable in bone-healthy cultures. However, drug-free polyelectrolyte particles alone showed no cytotoxicity or adverse effects on differentiation.Reduced drug content of 2,5 × 10-11 mol resulting in concentrations consistent with reported antiapoptotic effects on osteogenic cells, yielded no conclusive results. Donor dependent variability exceeded possible material effects by far and increased over experimental time. The depletion of osteocalcin after media change towards the end of the experiments needs further investigation.In conclusion, this study confirmed the compatibility of polyelectrolyte complex nanoparticles as a drug-delivering surface modification for implant materials with mesenchymal stromal cells during osteogenic differentiation as well as their ability to effectively release bone therapeutics. To be used together with risedronate, a stable release kinetic that prevents toxic initial concentrations and further testing in the low concentration range are needed. Keeping that in mind, risedronate loaded polyelectrolyte complex nanoparticles could help to locally improve implant stability and reduce complications of systemic drug administration.