Schätzung der absoluten Anzahl von Alveolarepithelzellen Typ 2 in Mauslungen : ein Vergleich zwischen Stereologie und Durchflusszytometrie

Abstract

Das Zählen und Schätzen von Zellen sind Aktivitäten, die routinemäßig sowohl in der medizinischen Diagnostik als auch in der Zell- und Molekularbiologie durchgeführt werden. Oftmals verlassen sich die Untersucher auf relative Zellzahlen. Das bedeutet beispielsweise, dass die Menge eines geschätzten Zelltyps entweder ins Verhältnis zu einem Gewebevolumen, zu einer bestimmten Querschnittsfläche oder zu anderen Zellen gesetzt wird. In Studien, in denen allerdings insbesondere die Organentstehung und -entwicklung aber auch der pathologische Umbau und die Reparatur eines Gewebes erforscht werden, können sich sowohl das Volumen, als auch die Zellmenge und -zusammensetzung in dem untersuchten Gewebeabschnitt sehr schnell und in großem Umfang verändern. In diesem Fall könnte die erwartungstreue Schätzung der absoluten Anzahl eines bestimmten Zelltyps aufschlussreicher sein. Zu diesem Zweck dient die Stereologie als der Goldstandard, ist jedoch eine vergleichsweise arbeitsintensive und zeitaufwendige Methode. Aus diesem Grund sollten in dieser Arbeit alternative Methoden zur Schätzung von absoluten Zellzahlen untersucht werden. Die Durchflusszytometrie wurde als eine solche schnelle und weniger arbeitsintensive Methode in Erwägung gezogen, die die Stereologie ersetzen könnte. Deshalb wurden die Stereologie als der Goldstandard und die Durchflusszytometrie als die alternative Methode miteinander verglichen und zwar bei der Schätzung der absoluten Anzahl von Alveolarepithelzellen Typ 2 (AEZ2) in den Lungen von zwei Mausstämmen: in den Wildtyp-Mäusen C57BL/6J und in den Sftpc-YFP Mäusen.Unter Verwendung der Durchflusszytometrie wurden in beiden Mausstämmen erheblich weniger AEZ2 geschätzt. Für die Wildtyp-Mäuse C57BL/6J wurden mithilfe der Durchflusszytometrie 41 % weniger AEZ2 im Vergleich zur Stereologie geschätzt (6,3 ± 1,2 Millionen versus 10,7 ± 1,4 Millionen). Für die Sftpc-YFP Mäuse wurden bei Gebrauch der Durchflusszytometrie sogar 77 % weniger AEZ2 im Vergleich zur Stereologie geschätzt (2,1 ± 0,4 Millionen versus 9,0 ± 0,7 Millionen). Diese Daten legen nahe, dass bei der Durchflusszytometrie der Zellgewinn aus dem dissoziierten Lungengewebe beeinträchtigt sein könnte, was zu einer niedrigeren Schätzung der absoluten Anzahl von AEZ2 führt. Das Fazit dieser Studie ist, dass die Stereologie die Methode der Wahl bei der erwartungstreuen Schätzung der absoluten Anzahl von Zellen in einem Organ bleibt. Counting and estimation of cells is an activity performed routinely in both medical diagnostics and cell and molecular biology research. Often, investigators rely on relative numbers of cells. This means for instance, that they put the abundance of a particular cell-type either in relation to the tissue volume, to a defined cross-sectional area or to other cells. However, especially in studies on organ genesis and development, and also pathological tissue remodelling and repair, the tissue volume may change rapidly and in a great amount, as well as the cell abundance, and the cell composition in the investigated tissue space. In such cases, the unbiased estimation of the absolute cell number of a particular cell-type could be more instructive. For this purpose, stereology serves as the gold standard, but is a comparatively labour-intensive and time-consuming approach. Therefore, the aim of this study was to examine alternative methods for the estimation of absolute cell numbers. Flow cytometry was considered as such a faster and less work-intensive method, which could replace stereology. Hence, stereology as the gold standard and flow cytometry as the alternative were compared by estimation of the absolute number of alveolar epithelial type 2 cells (AEC2) in the lungs of two mouse strains: wild type C57BL/6J mice and Sftpc-YFP mice.Substantially fewer AEC2 were estimated using flow cytometry in both mouse strains. For the wild type C57BL/6J mice, 41 % fewer AEC2 were estimated by using flow cytometry compared to stereology (6.3 ± 1.2 million versus 10.7 ± 1.4 million). For the Sftpc-YFP mice, even 77 % fewer AEC2 were estimated by using flow cytometry in contrast to stereology (2.1 ± 0.4 million versus 9.0 ± 0.7 million). These data suggest that there might be an impaired recoverability of AEC2 from dissociated lung tissue for flow cytometry, which leads to an underestimation of the absolute AEC2 number. The conclusion of this study is that stereology remains the method of choice for unbiased estimation of the absolute number of cells in an organ.