Identifizierung und Charakterisierung samenfaserkorrelierter Gene in Raps (Brassica napus L.)

Abstract

Die vorliegende Arbeit verfolgte das Ziel, Gene in der Kulturpflanze Raps (Brassica napus) zu identifizieren, die einen Einfluß auf den Fasergehalt im Schrot und auf die Samenfarbe haben. Kenntnisse über solche Gene und ihre Sequenzen ermöglichen die Entwicklung molekularer Marker, die in der markergestützten Selektion zur Züchtung hochwertiger Elite-Rapssorten mit verbesserter Schrotqualität eingesetzt werden können. Derartige Rapssorten bieten einen ökonomischen Mehrwert hinsichtlich der Verwertbarkeit des Nebenproduktes Rapsschrot als Futtermittel, da die bisher empfohlenen Anteile an den Futterrationen aufgrund einer besseren Verdaulichkeit inbesondere in der Geflügel- und Schweinefütterung erhöht werden können.Basis für diese Untersuchungen waren Ergebnisse, nach denen auf dem B. napus Chromosom A9 quantitative trait loci (QTL) für die Merkmale Samenfarbe und Samenfasergehalt identifiziert wurden. Die Arbeit wurde in die folgenden aufeinander aufbauenden Arbeitspakete gegliedert: 1. Feinkartierung der QTL: Auf Basis einer vorliegenden genetischen Karte und der Verankerung der genetischen Marker auf den zur Verfügung stehenden Referenz¬genomen von Arabidopsis thaliana und Brassica rapa wurden neue locusspezifische genetische Marker entwickelt. Mit diesen Markern wurde anschließend die Karte abgesättigt und der QTL-Bereich stärker eingegrenzt. 2. Sequenzierung des den QTL tragenden Chromosomenabschnitts: Mittels Hybridisierung einer Bacterial-Aritificial-Chromosome (BAC) -Bibliothek wurden BAC-Klone der schwarz¬¬sami¬gen B. napus-Linie Express 617 identifiziert und isoliert. Ausgewählte Klone, die den QTL-Bereich abdecken, wurden sequenziert. Der potentielle Geninhalt konnte über eine öffentliche B. rapa-Datenbank ermittelt werden und führte so zur Identifizierung das Kandidatengens Cinnamylalkoholdehydrogenase (Bra031216) im QTL-Bereich. 3. Vergleichende Kartierung: Genetische Marker aus verschiedenen Kartierungspopulationen wurden vergleichend kartiert, was schließlich darauf hindeutete, daß es sich offenbar um den gleichen QTL-Bereich handelt, also folglich auch um dieselben Gene. Das Kandidatengen Cinnamoyl-CoA-Reduktase (Bra026737) wurde durch Vergleich der QTL-Region in der genetischen Karte in einer chinesischem Rapspopulation mit der physischen B. rapa-Karte von Chromosom A9 identifiziert. 4. Sequenzierung der Kandidatengene: Die beiden vorgenannten Kandidatengene wurden in den verwendeten Kartierungseltern 1012-98, Express 617, V8, P174 und GH06 sequenziert. Dazu wurden spezifische Primer für die Amplifizierung der Exons entwickelt. 5. Sequenzvergleich: Die Sequenzdaten aller Genotypen wurden gruppiert und die resultierenden Konsensus-Sequenzen gegen die jeweiligen Referenzsequenzen aus B. rapa und B. oleracea kartiert. Danach konnten die Sequenzen miteinander verglichen werden, um Unterschiede, die einen potentiellen phänotpischen Effekt haben könnten, zu identifizieren. Eine Reihe von single nucleotide polymorphisms (SNPs), Deletionen, Insertionen und resultierende Aminosäuresubstitutionen wurden hierbei identifiziert.Im Ergebnis zeigen die Studien, dass die Gene Cinnamylalkoholdehydrogenase (CAD) und Cinnamoyl-CoA-Reduktase (CCR) gemeinsam für die Variation des ADL-Gehaltes in B. napus-Samen maßgeblich verantwortlich sind. Diese Gene kodieren für Enzyme, die die beiden letzten aufeinanderfolgenden Syntheseschritte für Monolignole katalysieren. In beiden Genen konnte eine hohe Sequenzvariation beobachtet werden. Eine neuartige Genstruktur für CAD wurde sowohl in allen untersuchten Rapsgenotypen als auch in B. rapa identifiziert: Das Gen geht augenscheinlich auf die Fusion (Chimäre) zweier Kopien eines Gentandems zurück, wie es in A. thaliana vorliegt. Der Genotyp 1012-98 mit niedrigem ADL-Gehalt besitzt keine intakte A-Kopie von CAD. Von CCR konnte eine chimäre Form aus den A- und C-Genom-Homöologen identifiziert werden. In GH06 wurde die C-Genom-Kopie des Gens CCR durch eine defekte Kopie des A-Genom-Locus ersetzt. CAD liegt hier wahrscheinlich als eine chimäre Form aus den A- und C-Genom-Homöologen vor. V8, der Genotyp mittleren ADL-Gehalts trägt dagegen sowohl von CAD als auch von CCR je eine defekte Kopie und je eine möglicherweise nicht oder nur teilweise funktionale Kopie der Gene. Die hoch-ADL Genotypen Express 617 und P174 verfügen über intakte CAD- und CCR-Kopien. Es wird aus dieser Studie also deutlich, daß ganz unterschiedliche Mutationen und ihre Kombinationen in den Kopien der beiden untersuchten Gene zu Variationen im Gehalt und vermutlich auch der Zusammensetzung des Parameters ADL in B. napus-Samen geführt haben. Dies zeigt, wie genetisch komplex die Lignin- bzw. Rohfaser-Fraktion in Rapssaat determiniert ist. Aus den Erkenntnissen dieser Arbeit ergeben sich daher neue Ansätze für die Entwicklung nutzbarer molekularer Selektions¬marker. This study aimed at identifying genes in the crop plant oilseed rape (Brassica napus, canola) which have influence on the fibre content and colour of the seeds. Knowledge about such genes and their sequences helps to develop molecular markers that can be used in marker-assisted selection (MAS) for breeding of new elite varieties with improved meal quality. Such varieties offer added economic value, because oilseed rape ratios in animal feeding, especially for poultry and pigs, can be increased due to improved digestibility of the meal. The work was based on results identifying quantitative trait loci (QTL) on Brassica napus chromosome A9 for relevant seed colour and fibre traits. The study was divided into the following consecutive sub-projects: 1. Fine mapping: Based on an existing genetic map and anchorage of molecular markers to the available reference genomes of Arabidopsis thaliana and Brassica rapa new locus-specific molecular markers were developed. These markers were used to saturate the genetic map and to narrow down the QTL region on chromosome A9. 2. Sequencing of the chromosomal area containing the QTL region: Bacterial artificial chromosome (BAC) library hybridisation was used to identify and isolate large-insert genomic clones from the black-seeded B. napus line Express 617. Clones spanning the QTL region were sequenced. The potential gene content was identified using a publicly available B. rapa database. This led to identification of the candidate gene Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (Bra031216) in the QTL region. 3. Comparative mapping: Genetic markers developed in different mapping populations were comparatively mapped, suggesting that the QTL region investigated and the underlying genes are the same in both studies. The candidate gene Cinnamoyl CoA Reductase (Bra026737) was identified by comparison of the QTL region in a genetic map from Chinese B. napus with the corresponding physical B. rapa map of chromosome A9. 4. Sequencing of the candidate genes: The aforementioned candidate genes were sequenced in the mapping parents 1012-98, Express 617, V8, P174 and GH06. Specific primers for amplification of the exon sequences were developed. 5. Sequence comparison: Sequence data of all genotypes were grouped. The resulting consensus-sequences were mapped against the reference sequences of B. rapa and B. oleracea. Subsequently, the sequences were compared in order to identify differences with a potential phenotypic effect. A number of single nucleotide polymorphisms (SNPs), deletions, insertions and resulting amino acid exchanges were thus identified. In summary, the studies reveal that the genes Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) and Cinnamoyl CoA Reductase (CCR) both influence the variation of ADL content and composition in the B. napus seeds. These genes encode enzymes, which catalyze the two final steps in the monolignol biosynthesis. In both genes a high variability of the sequences was observed. A novel gene structure for CAD was identified in all investigated B. napus genotypes and in B. rapa: The gene apparently originates from a fusion (chimera) of two gene copies belonging to a tandem repeat structure as it occurs in A. thaliana. The genotype 1012-98, with low ADL content, completely lacks an A genome copy of CAD. A chimeric copy formed from parts of the A and C genome homoeologues of CCR was identified in this genotype. In GH06 the C-genome copy of CCR is replaced by a defect copy of the A-genome locus. Apparently, CAD occurs as a chimeric structure of the A and C genome homeologues. On the other hand, the medium-ADL genotype V8 carries one defect and one non-functional or only partially functional gene copy of both CAD and CCR. The high ADL genotypes Express 617 and P174 contain intact CAD and CCR gene copies. The study makes clear that not only different mutations, but also combinations thereof in the copies of the two investigated genes lead to variation of the content and presumably composition of ADL in B. napus seeds. The results underline the genetically complex determination of this particular trait in rapeseed. The results of the present study revealed new approaches to develop molecular markers suitable for marker-assisted selection.