Multiple Funktionen des SAM-II Riboswitches in Sinorhizobium meliloti

Abstract

In Sinorhizobium melitloti besitzen die Methioninbiosynthesegene metZ und metA in der 5' nicht translatierten Region S-Adenosyl-L-Methionin (SAM) Riboswitches der Klasse II. In dieser Arbeit wurde die Rolle der SAM-II Riboswitches in der Regulation der metZ und metA Expression untersucht. Zuerst wurde mit bioinformatischer Strukturmodellierung vorhergesagt, dass nach SAM-Bindung der metZ Riboswitch einen Rho-unabhängigen Terminator bildet. Als Konsequenz wird die Transkription vorzeitig beendet und dabei wird die sRNA RZ generiert. Für den metA Riboswitch wurde eine translationale Regulation, durch die Kontrolle der Zugänglichkeit der Shine-Dalgarno (SD)1 Sequenz des putativen Startcodons AUG1, vorhergesagt. Jedoch befindet sich 69 nt stromabwärts, im Leserahmen von AUG1, ein weiteres AUG (AUG2) mit möglichen SD Sequenzen (SD2 und SD3). Zudem wurde zwischen AUG1 und AUG2 ein Rho-unabhängiger Transkriptoinsterminator vorhergesagt und mit Hilfe von egfp-Reporterfusionen experimentell validiert. Die Ergebnisse zeigen, dass dieser Terminator die metA Expression stark begrenzt. Dabei entsteht die sRNA RA1, die wahrscheinlich weiter zur sRNA RA2 prozessiert wird. Verglichen mit Bedingungen niedriger intrazellulärer SAM-Konzentration (Wachstum in Minimalmedium, MM), waren unter Bedingungen hoher SAM-Konzentration (Wachstum im reichen TY-Medium) die SAM-II Riboswitch enthaltende sRNAs, RZ und RA2, abundanter, während die Menge der metZ und metA mRNAs niedriger war. Außerdem wurde gezeigt, dass generell in der Zelle die sRNAs weitaus abundanter vorkommen als ihre zugehörigen mRNAs. Im Vergleich zu MM-Kulturen war die Stabilität der SAM-II Riboswitch enthaltenden sRNAs und mRNAs in TY-Kulturen höher, während die Aktivität der metZ- und metA- Promotoren niedriger war. Mit egfp-Reporterfusionen wurde auch nachgewiesen, dass die Translation von metA am AUG2 beginnt und für eine effiziente Translation SD1 (unmittelbar stromabwärts des Riboswitches) sowie SD2 und SD3 (vor AUG2) relevant sind. Somit werden bei diesem neuen Translationsinitiationsmechanismus Ribosomen erst an die SD1 (standby Region) gebunden, um die Translation 69 nt stromabwärts zu initiieren. Mittels einer Mutation in der SAM-Bindetasche in einer Reporterfusion wurde die Rolle des metA Riboswitches weiter untersucht. Die Ergebnisse legen nahe, dass der Riboswitch im SAM-gebundenen Zustand die Zugänglichkeit der SD1 negativ reguliert und gleichzeitig die mRNA stabilisiert. Wahrscheinlich gewährleistet diese duale konträre Regulation durch den SAM-II Riboswitch ein basales metA mRNA-Niveau bei schnell wechselnden Umweltbedingungen und trägt so zur SAM-Homöostase bei.