Relevanz und Funktion des N-terminalen Fragmentes des kardialen Myosin-bindenden Protein C nach myokardialer Ischämie

Abstract

Einleitung Das kardiale Myosin-bindende Protein-C (cMyBP-C) ist ein Strukturprotein, das in Kardiomyozyten exprimiert wird und kürzlich als neuer Biomarker für die myokardiale Ischämie beschrieben wurde. Dessen N-terminales Fragment, C0-C1f, wird innerhalb der ersten Minuten nach myokardialer Ischämie durch μ-Calpain-abhängige Spaltung von cMyBP-C freigesetzt und spielt eine entscheidende Rolle bei der Initiierung von Inflammation in Makrophagen. Langfristige C0-C1f-Exposition induziert bei transgenen Mäusen eine kardiale Fibrose; der Mechanismus, durch den C0-C1f die Fibrose verursacht, ist jedoch unklar. Das Ziel dieser Studie war es, die Relevanz von C0-C1f nach myokardialer Ischämie und seine Auswirkungen auf Fibroblasten zu untersuchen. Methoden Es wurde ein Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) zur Detektion von C0-C1f etabliert. Hierfür wurde der cMyBP-C Quantifizierung eine Depletion vorangeschaltet, so dass spezifisch C0-C1f gemessen werden konnte. Darüber hinaus wurde der Einfluss von C0-C1f auf das Transkriptom von murinen kardialen sowie humanen Fibroblasten analysiert. Dazu wurden primäre murine kardiale Fibroblasten sowie eine humane Fibroblasten-Zelllinie (huFib) über unterschiedliche Zeiträume mit C0-C1f behandelt. Inflammatorische und fibrotische Reaktionen wurden auf mRNA- und Proteinebene mit verschiedenen Techniken bewertet, darunter Microarray, RT-qPCR, Western Blotting sowie immunhistochemische Färbungen. Die zugrunde liegenden Signalwege wurden durch KEGG-Analysen, Western Blots sowie mittels konventioneller Inhibitoren analysiert. Ergebnisse Bei Patienten mit einem akuten Koronarsyndrom scheinen 40 % des freigesetzten cMyBP-C C0-C1f zu sein. Folglich wurde der Einfluss von C0-C1f auf Fibroblasten untersucht. C0-C1f induzierte überwiegend pro-inflammatorische Reaktionen in murinen und humanen Fibroblasten. C0-C1f verursachte jedoch keine Differenzierung von Fibroblasten zu Myofibroblasten mit erhöhtem intrazellulärem ACTA2/αSMA. KEGG-Analysen und Western Blots zeigten, dass C0-C1f hauptsächlich den TLR4/NFκB-Signalweg aktiviert. Dementsprechend induzierte C0-C1f die Phosphorylierung von ERK1/2, aber eine Aktivierung des SMAD-Signalwegs durch C0-C1f wurde nicht beobachtet. Die Hemmung von TLR4 oder NFκB führte zu einer signifikant geringeren Induktion von Zytokinen und Chemokinen. Fazit C0-C1f wird nach myokardialer Ischämie bei Patienten mit einem ACS freigesetzt. In-vitro induziert C0-C1f über den MAPK/ERK und NFκB Signalweg Inflammation in Fibroblasten, während der pro-fibrotische TGF-β/SMAD-Signalweg nicht aktiviert wird. Die Aktivierung von ERK1/2 durch C0-C1f gibt erste Hinweise auf den Regulationsmechanismus. Eine direkte Wirkung von C0-C1f auf Fibroblasten, die zur Differenzierung in Myofibroblasten führt, wurde jedoch nicht beobachtet. Zusammengenommen stimmen diese Daten mit der Hypothese überein, dass C0-C1f auch in Fibroblasten eine Schlüsselrolle bei der Initiierung von Inflammation nach einer myokardialen Ischämie spielt. C0-C1f könnte zur kardialen Fibrose beitragen, indem es zu späteren Zeitpunkten weitere Zellen, wie beispielsweise Makrophagen, aktiviert.