Untersuchung der GAP-katalysierten GTP-Hydrosereaktion von Ras und Rap

Abstract

Ein Ziel dieser Arbeit bestand in der Entwicklung einer Leitsubstanz für die Herstellung eines Anti-Tumorpräparates, das an der defektenGTPase-Funktion von onkogenem Ras ansetzen sollte. Für die Entwicklung eines deratigen Wirkstoffes durch drug design spricht aufgrundder Tatsache, dass in 30% aller menschlichen Tumore onkogene Ras-Mutationen gefunden werden, die Singularität des Angriffspunktes.Um einen Ausgangspunkt für molekulares drug design zu erhalten, wurden Peptidbibliotheken entworfen, synthetisiert und aufRasGAP-Aktivität untersucht. Unter Zuhilfenahme der Röntgenkristallstruktur des Komplexes von Ras mit seinem GTPase-aktivierenden Protein im Übergangszustandder GTP-Hydrolysereaktion und eines Vergleiches der bekannten RasGAP-Sequenzen, wurden eine Kernsequenz identifiziert, die alsGrundlage für den Entwurf der kombinatorischen Peptidbibliotheken diente. Alle Peptide besitzen die gemeinsame Kernsequenz (RGQ),die von definiert und zufällig variierten Aminosäuren flankiert wird. Jede Bibliothek besitzt eine Komplexität von 160000 verschiedenenPeptiden. Zusammen enthalten alle Bibliotheken somit 64 Millionen verschiedene Peptide. Die Bibliotheken wurden in Kooperation mit derArbeitsgruppe Molekulare Erkennung von Dr. Ronald Frank aus an Festphasen gekoppelten Peptiden nach der sogenanntenSPOT-Synthese-Methode hergestellt. Zum Nachweis von GAP-Aktivität wurden die einzelnen Peptidbibliotheken parallel inMikrotiterplatten mit onkogenem und wt Ras, das zuvor mit radioaktiv markiertem GTP beladen wurde, inkubiert. Zur Quantifizierung derAktivität wurde ein eigens für das Mikrotiterplattenformat adaptierter und modifizierter Filterbindungstest durchgeführt. Es wurden nebenlinearen auch zyklisierte Peptidbibliotheken getestet. In den durchgeführten Tests konnte kein Peptid mit GAP-Aktivität identifiziert werden. Der zweite Teil dieser Arbeit galt der Untersuchung des GTPase-aktivierenden Proteins Rap1GAP für das Ras-homologe Protein Rap1.Besonders berücksichtigt wurde dabei die Frage, ob sich Rap1GAP wie die GAP für Ras, Rho und Ran ebenfalls eines sogenanntenArgininfingers bedient, um die intrinsische GTP-Hydrolysereaktion der jeweiligen kleinen GTPase zu beschleunigen. Hierzu wurde zunächstein Protokoll für die Herstellung eines katalytischen Fragments als GST-Fusionsprotein in E. coli und die anschließende Reinigungetabliert. Die maximale Geschwindigkeit der von Rap1GAPv katalysierten GTPase-Reaktion von Rap1A wurde nach Michaelis-Menten mit5,6 s-1 bestimmt, der KM-Wert wurde mit 52,3 µM bestimmt. Aufgrund der eingeschränkten Stabilität des Fragments konnte die Affinitätvon Rap1GAPv zu Rap1 nicht exakt bestimmt werden. Nach Herstellung von Rap1GAPv-Varianten, in denen je eine konservierte Argininseitenkette durch eine Lysin- oder Alaninseitenkettesubstituiert wurde, konnte durch kinetische Untersuchung der katalytischen Eigenschaften gezeigt werden, dass keine derArgininseitenketten einen Einfluss auf die GTP-Hydrolysereaktion aufweist, der dem des Argininfingers von RasGAP vergleichbar ist.Durch weitere kinetische Untersuchungen mit Rap1GAP-Varianten, in denen konservierte polare Aminosäurenseitenketten von Rap1GAPdurch Alaninseitenketten ersetzt wurden, konnte Lysin 285 als katalytisch relevante Seitenkette identifiziert werden. Damit verwendetRap1GAP möglicherweise einen Lysin-Finger zur Katalyse der GTPase-Reaktion von Rap1. In weiteren Mutagensestudien wurden die Aminosäureseitenketten Glycin 12 und Tyrosin 32 von Rap1A durch Valin respektive Tryptophanersetzt. Im Gegensatz zu den analogen Substitutionen bei Ras zeigte sich die GTPase-Reaktion der G12V-Variante als GAP-stimulierbar,wohingegen die Y32W-Variante ebenfalls von der Situation bei Ras abweichend nicht durch GAP zu stimulieren ist. Eine direkteBeteiligung der Hydroxylgruppe des Tyrosins konnte durch die Untersuchung einer Variante mit der Substitution Y32F ausgeschlossenwerden. Zusammen mit der Tatsache, dass im Gegensatz zu allen anderen GTPasen bei Rap das streng konservierte Glutamin des MotivsPM3 durch ein Threonin ersetzt ist, resultiert aus den Untersuchungen dieser Arbeit die Annahme eines alternativenGTP-Hydrolysemecha-nismus für die Rap1GAP-katalysierte GTP-Hydrolyse von Rap.