Identifizierung von Genen, die durch fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) reguliert werden

Abstract

FGF-Rezeptoren sind an der Regulation zahlreicher physiologischer Vorgänge beteiligt. Weiterhin können Mutationen in den Genen fürFGFR1, FGFR2 und FGFR3 zu autosomal-dominant vererbten Craniosynostosesyndromen führen. Besonders häufig sind dabeiMutationen im FGFR2-Gen. Die Identifizierung von durch FGFR2 regulierten Genen kann das molekulare Verständnis FGFR-regulierternormaler und abnormaler Prozesse vertiefen. Zur Identifizierung FGFR2-regulierter Gene wurde ein in vitro-System an der Zellinie L6(Rattenmyoblasten) etabliert. L6-Zellen exprimieren ihre FGFR-Gene nicht. Die L6-Zellen wurden durch Transfektion mit der humanenFGFR2-cDNA zur FGFR2-Expression gebracht. Dabei wurden die zwei FGFR2-exprimierenden L6-Klone BEK26 und WT26 isoliert. Beiden Zellinien war die FGFR2-Expression auf RNA-Ebene nachweisbar und in WT26-Zellen darüberhinaus auch auf Protein-Ebene. DieRNA aus FGF2-behandelten Zellen beider Klone wurde auf FGFR2-regulierte Gene hin untersucht. Hierzu wurden DifferentialDisplay-Analysen an der RNA aus BEK26-Zellen und cDNA-Expressionsarray-Analysen an der RNA von WT26-Zellen durchgeführt. Inbeiden Ansätzen wurden zunächst Hinweise auf FGF2/FGFR2-regulierte Gene bzw. Geneffekte gefunden. So konnte über das DifferentialDisplay der RNA von BEK26-Zellen nach FGF2-Behandlung eine verstärkte Fragmentierung der mitochondrialen 16S-rRNA detektiertwerden. Die Array-Analysen ergaben Hinweise, wonach in WT26-Zellen FGF2-vermittelt die Expression der Gene TA1 und Fyn vermindertzu sein schien. In Northern Blot-Analysen wurde außerdem in einem Experiment eine erniedrigte Expression des TranskriptionsfaktorsMyoD nach FGF2-Behandlung der WT26-Zellen detektiert. Diese Effekte sind jedoch nicht sicher auf die Aktivierung von FGFR2 zurückzuführen, da sie nur zum Teil (TA1 und Fyn) oder gar nicht(MyoD) reproduzierbar waren, auch unabhängig von FGFR2 Expressionsunterschiede beobachtet wurden (TA1 und Fyn in V1-Zellen, diekeinen FGFR2 exprimieren) oder die Translation des FGFR2-Proteins in den BEK26-Zellen letztlich nicht nachweisbar war (wodurch dieFragmen-tierung der mitochondrialen 16S-rRNA nicht als FGFR2-vermittelt angesehen werden kann). Es ist demnach nicht gelungen, mit dem in dieser Arbeit gewählten experimentellen Ansatz gesicherte FGFR2-regulierte Gene zuidentifizieren. Da das Differential Display und das Array-System sich prinzipiell als geeignet erwiesen haben, Unterschiede in der Expression von Genenzu detektieren, liegt der Schwachpunkt des in dieser Arbeit gewählten experimentellen Ansatzes möglicher-weise in der Verwendung derL6-Zellen. Es ist nicht bekannt und bleibt offen, ob L6-Zellen für Studien geeignet sind, die die Identifizierung von downstream-Genen einesFGF-Rezeptors zum Ziel haben. Die Negativbefunde dieser Arbeit legen jedoch nahe, dies in Frage zu stellen. Die biologischeKomponente dieses Versuchsan-satzes könnte beispielsweise ersetzt werden durch Gewebe von transgenen Tieren oder durch primärehumane Osteoblastenkulturen. Es sollte dann versucht werden, mit Hilfe dieser RNA-Quellen FGFR2-regulierte Gene zu ermitteln. AlsUntersuchungsmethode wäre hierbei das anscheinend effektivere cDNA-Array-System dem Differential Display vorzuziehen.