Untersuchung der DNA-Spaltung durch die komplexe GTPase McrBC aus Escherichia coli K-12 : In-vitro-Experimente mit den Untereinheiten McrB und McrC sowie Vorstellung eines neuen Modells zur Enzymologie von McrBC

Abstract

McrBC ist ein in Escherichia coli K-12 vorkommendes multimeres Enzym, welches die Spaltung bestimmter methylierter DNA katalysiert.Von den derzeit rund 3500 bekannten Restriktionsenzymen stellt das McrBC-System die einzige Restriktionsendonuklease dar, derenDNA-spaltende Aktivität obligat von der Hydrolyse von GTP abhängig ist. McrBC läßt sich nicht in das gängige Klassifizierungsschema vonRestriktionsendonukleasen einordnen und erweitert das bekannte Funktionsspektrum von GTPasen um den Aspekt der Interaktion mitDNA. Die GTPase-Funktion des McrBC-Systems ist in einer von zwei Domänen der Untereinheit McrB lokalisiert, die auch in vivo alsverkürzte Variante (McrBs) durch Verwendung eines alternativen Translationsstarts des mcrB-Gens entsteht. Durch die bei McrBs fehlendeaminoterminale Domäne des vollständigen McrB-Proteins wird die DNA-Sequenzspezifität des Restriktionssystems bestimmt. DieUntereinheit McrC stellt wahrscheinlich die Endonuklease des Systems dar. Für eine DNA-Spaltung in vitro werden nur die UntereinheitenMcrB und McrC benötigt, aber nicht McrBs, welchem wahrscheinlich eine regulatorische Funktion zukommt. An DNA-Sequenzen der Form5´-RmC-3´ (mit mC = 5-Methylcytosin, 5-Hydroxymethylcytosin oder N4-Methylcytosin) bilden McrB und McrC höhermolekulare Komplexe,die die DNA zu spalten vermögen, wenn bestimmte Voraussetzungen gegeben sind. Hierzu gehören neben bestimmtenMilieubedingungen, die die Anwesenheit der beiden essenziellen Kofaktoren Mg2+-Ionen und GTP umfassen, besondere Eigenschaftender DNA, die in der vorliegenden Arbeit untersucht wurden. Im experimentellen Teil dieser Arbeit erfolgte die Aufreinigung derUntereinheiten McrB und McrC sowie Varianten von McrB, die in in-vitro-Experimenten eingesetzt wurden, die hauptsächlich derUntersuchung der DNA-Bindung und -Spaltung verschiedener DNA-Substrate durch das McrBC-System dienten. Unter Anwendungverschiedener Methoden wurden eine Reihe von Ergebnissen erzielt, die DNA-spaltaktive McrBC-Komplexe als eine recht dynamischeStruktur zeigen. Im Einzelnen lassen die Resultate der vorliegenden Arbeit folgende Aussagen zu: Die systemspezifische Erkennungssequenz von McrBC lautet 5´-RmC-3´. Eine singuläre Sequenz dieser Art reicht für die Entstehung spezifischer Bindungsereignisse durch McrB aus. Sequenzen der Art 5´-RC-3´ oder 5´-YmC-3´ haben keinen Einfluss auf die DNA-Spaltung durch McrBC. Die spezifischen DNA-Bindungseigenschaften des McrBC-Systems sind in der aminoterminalen Domäne von McrB lokalisiert. Diese interagiert als eigenständiges Protein (McrB1-162) nicht mit ihresgleichen und bindet im Verhältnis 1 : 1 an die Erkennungssequenz. Auch die Bindung an nah benachbarte Erkennungssequenzen erfolgt unabhängig voneinander. Das Protein McrB vollständiger Länge ist ein Pseudoheterodimer und bildet an spezifischen DNA-Sequenzen oligomere Proteinkomplexe, wobei die Wechselwirkung zwischen McrB-Untereinheiten wahrscheinlich über die carboxyterminale Domäne der Proteine erfolgt. Die beiden Kofaktoren, Mg2+-Ionen und GTP, modulieren die Oligomerisierung von McrB. Ohne die Kofaktoren werden keine funktionellen McrBC-Komplexe gebildet. Die Anzahl spezifischer Sequenzen sowie deren Abstand im DNA-Substrat hat, im Unterschied zu deren Orientierung, sowohl deutlichen Einfluss auf den Aufbau von McrB-Komplexen an der DNA als auch auf die Effizienz der DNA-Spaltung durch McrBC. Beide Effekte werden sowohl durch eine Erhöhung der Anzahl von McrBC-Erkennungssequenzen im DNA-Substrat als auch durch Verringerung deren Abstände zueinander verstärkt. Bezüglich der DNA-Spaltung gibt es einen optimalen Abstandsbereich zweier 5´-RmC-3´-Sequenzen von ungefähr 40 bis 100 bp. Mit zunehmender Abweichung von diesem Bereich in Richtung größerer Abstände nimmt die Spaltungseffizienz durch McrBC langsam, in Richtung kleinerer Abstände sehr schnell ab. Die Häufigkeit der durch McrBC erzeugten DNA-Doppelstrangbrüche zwischen zwei Erkennungssequenzen wird durch die zusätzliche Anwesenheit einer oder mehrerer Erkennungs-sequenzen im gleichen DNA-Molekül in deren Nähe deutlich erhöht, dabei verschiebt sich die statistische Verteilung der McrBC-Spaltungen in Richtung der zusätzlichen Sequenzen. Einen ähnlichen Effekt können auch unmethylierte Sequenzen verursachen, die einen nur wenige Basenpaare langen Abstand einer Erkennungssequenz zum Ende eines linearen DNA-Substrats vergrößern. Eine allosterische Aktivierung der DNA-Spaltung durch McrBC durch die Anwesenheit zusätzlicher Erkennungssequenzen in anderen DNA-Molekülen findet nicht statt. McrBC vermag geeignete DNA-Substrate an mehreren Stellen zwischen zwei Erkennungssequenzen durchzuspalten, wobei der Enzymkomplex jeweils nur eine Durchspaltung in der Nähe einer der beiden Erkennungssequenzen verursacht. Die bei einem Doppelstrangbruch in den beiden DNA-Strängen durch McrBC verursachten Spaltungen sind dabei in ihrer Position unabhängig voneinander, McrBC verursacht also kein spezifisches Muster von Überhängen bei der Spaltung von doppelsträngiger DNA. In den Abschnitten zwischen zwei Erkennungssequenzen, wo durch das McrBC-System DNA-Spaltungen verursacht werden, besitzt das McrBC-System innerhalb der einzelnen DNA-Stränge mehrere sehr deutlich bevorzugte Schnittpositionen. Diese stehen in keinem festen Entfernungsverhältnis zu einer oder zu beiden Erkennungssequenzen und sind unabhängig von der lokalen Sequenz der DNA, sind aber untereinander periodisch durch 10 bis 11 bp getrennt. Die Übereinstimmung dieses Abstands mit einer kompletten Umwindung der B-DNA-Doppelhelix begründet sich wahrscheinlich aus dem Mechanismus der Komplexbildung von McrBC. Durch die Integration der in dieser Arbeit gewonnenen experimentellen Resultate in den Kontext der bekannten Daten über McrBC, die vorallem in jüngerer Zeit veröffentlicht wurden, und durch Vergleiche des McrBC-Systems mit anderen Restriktionsendonukleasen und mitanderen mit DNA interagierenden Enzymsystemen konnte in dieser Arbeit eine neue Modellvorstellung der Funktionsweise desMcrBC-Restriktionssystems entwickelt werden. Diese beschreibt die GTP-Hydrolyse durch McrB als notwendig für den AufbauDNA-spaltaktiver McrBC-Komplexe. Die Untereinheit McrB bewirkt als NTP-aktiviertes Signalmolekül weiterhin über die Hydrolyse desKofaktors eine DNA-Translokation durch den Komplex, die möglicherweise durch die Untereinheit McrC bewirkt wird. Analog zu denHsdR-Untereinheiten der Typ I Restriktionsenzyme verursachen die translozierenden Untereinheiten durch ein externes Signal, das auseiner mechanischen Behinderung der DNA-Translokation bei sich fortsetzender GTP-Hydrolyse besteht, eine DNA-Spaltreaktion, dieanalog zu den ebenfalls DNA-Translokation betreibenden Typ III Restriktionsenzymen in der Nähe der Erkennungssequenz erfolgt. In dem indieser Arbeit beschriebenen Modell zum Ablauf der DNA-Spaltung durch McrBC hat die Hydrolyse des Kofaktors durch McrB nicht dieausschließlich Funktion einer Energiequelle für den Antrieb einer DNA-Translokation, sondern moduliert die Aktivität der UntereinheitMcrC. Damit unterscheidet sich dieses Modell von den bisher beschriebenen Vorstellungen, die die Funktion der GTP-Hydrolyse durchMcrB nicht beschreiben oder von einer Rolle der GTP-Hydrolyse als direktem Antrieb der Translokation ausgehen, analog zu derATP-Hydrolyse von Motorproteinen.