Isolierung und Analyse eines Bindungsglobulins für Herzglykoside aus Rinderblut

Abstract

Die pflanzlichen Herzglykoside Ouabain und Digoxin regulieren nach neueren Erkenntnissen in Säugetieren als Steroidhormone derNebenniere den Salz- und Wasserhaushalt. Da Steroidhormone gebunden an spezifische Bindungsproteine im Blut transportiert werden,sollte ein neu nachgewiesenes Bindungsprotein für Herzglykoside aus Rinderblut gereinigt und weiter charakterisiert werden. Nach dem Nachweis des Herzglykosidbindungsproteins CGBG durch Affinitätsmarkierung mit dem proteinreaktiven DigoxigeninderivatN-hydroxysuccimidyl-Digoxigenin-3-o-methyl-aminocaproat (HDMA) gelang es spezifische Antikörper zu gewinnen. Damit konnte dasBindungsglobulin CGBG aus der Globulinfraktion des Rinderserums 900 000-fach gereinigt werden. Hierzu waren eine Vorreinigung desProteins am Kationenaustauuscher CM-Sephadex, eine Affinitätschromatographie an einer spezifischen Antiköpersäule und eineNachreinigung an der Anionenaustauschersäule Phenomenex Biosep DEAE erforderlich. Die Proteinausbeute der in 3 Tagendurchzuführenden Proteinreinigung betrug 0,0001%. Das Herzglykosidbindungsprotein ist ein Glykoprotein von Mr 90 kDa in der SDS-PAGE. Der N-Terminus ist durch Pyroglutamat blockiert.Nach Deblockierung mit Pyroglutamase kann durch Edman Abbau die Sequenz ALPNVETSV bestimmt werden. Für sie und eine weiteremit Lys-C erhaltene Sequenz KDLESHYLFERH, sowie eine durch CNBr-Spaltung erhaltene Sequenz GKLFNIVNKXQQAL fanden sich inden SwissProt- und TrEMBL-Datenbanken keine Sequenzhomologien. Das Protein ist somit bisher unbekannt. Der Kohlenhydratanteil desCGBG enthält u.a. Neuraminsäuren, wie durch Interaktion mit verschiedenen Lektinen bestimmt werden konnte. Die N-glycosidisch amProtein gebundenen Kohlenhydrate tragen 10-15% zur Molmasse bei. Unterschiedliche Glykosylierungsmuster erklären die Heterogenitätdes IEP des nativen Proteins zwischen pH 4,4 und 5,6; denn nach Deglykosylierung ist der IEP 5.6. Mittels Molekularsiebchromatographieergab sich für das native CGBG eine Molmasse von 820 kDa und unter denaturierende Bedingungen von 180 kDa. Es wird darausgeschlossen, daß das Herzglykosidbindungsprotein ein Pentadimer von 180 kDa ist, in dem die Monomere von 90 kDa durchDisulfidbrücken verknüpft sind. Mittels Affinitätsmarkierung mit HDMA und mittels Tryptophanfluoreszenzlöschung wurden die spezifische Interaktion des gereinigtenProteins mit Herzglykosiden nachgewiesen. Es gelang 2 Bindungsstellen unterschiedlicher Affinität von Kd1 = 2,4 nM und von Kd2 = 500 nMnachzuweisen. Das Protein interagiert nicht mit anderen Steroidhormonen. Gegen das isolierte 90 kDa-Herzglykosidbindungsprotein konnten in Kaninchen spezifische polyklonale Antikörper erzeugt werden. Sieerkannten nur die 90 kDa Proteinbande in einer teilweise gereinigten Proteinfraktion. In contrast to the general assumption, ouabain and digoxin, which are plant-derived cardiac glycosides, are steroid hormones of themammals. They regulate the salt and water metabolism. In general, steroid hormones are transported in blood as complexes with steroidbinding proteins. Hence it was the intention of this work to identify and to characterize such a binding protein for cardiac glycosidse inbovine blood. The cardiac glycoside binding globulin (CGBG) identified in a partially purified serum preparation by affinity labeling with theprotein-reactive digoxigenin derivative N-hydroxysuccimidyl-Digoxigenin-3-O-methyl-aminocaproate (HDMA) was used to immunizerabbits. The antibodies raised were immoblilized to prepare an affinity column. This was an essential step to purify CGBG 900,000-foldfrom bovine blood serum. Purification was performed in 3 days. It included the following steps: Ammonium sulfate precipation (50%),CM-Sephadex cation exchange chromatography, affinity chromatography on an anti-CGBG Sepharose Fast Flow column, anion exchangechromatography on Phenomenex BioSep DEAE. The protein yield of pure CGBG was 0.0001 % The isolated cardiac glycoside binding protein shows a band at 90kDa on SDS-PAGE. Its N-terminus is blocked by pyroglutamate. Theamino acid sequence ALPNVETSV was determined when CGBG was digested with pyroglutamatase. Other sequences obtained wereKDLESHYLFERH (digestion with Lys-C) and GKLFNIVNKXQQAL (hydrolysis with CNBr). All sequences were not found in data banks(SwissProt and TREMBL). CGBG contains N-glycosidic bound carbohydrates which contribute to 10-15% of the molecular mass. The IEP of the native protein is between pH 5.6 and 4.4. Deglycosilated protein shows only one spot at 75kDa and an IEP at pH 5.6 in2D-Electrophoresis. The calculated mass from size exclusion chromatography is 820 kDa for the native and 180 kDa for the denaturedprotein. It is concluded that native CGBG circulates as an pentadimer of 90 kDa monomers that are covalently dimerized by disulfide bonds The intrinsic tryptophane fluorescence quenching experiment using cardiac glycosides as ligands indicates two binding sites with a high(KD1 = 2.4 nM) and low (KD2 = 500 nM) affinity binding site. Polyclonal antibodies raised in rabbits against the CGBG recognise specificallythe cardiac glycoside binding globulin in a semipurified preparation of CGBG.