Die Vesikel des Poliovirus-Replikationskomplex entstehen an den Membranen des endoplasmatischen Retikulums unter Verwendung der zellulären COPII-Proteine

Abstract

Poliovirus gehört zur Familie der Picornaviridae, die unbehüllte animal- und humanpathogenen Viren umfasst, die ein einzelsträngiges RNA-Genom positiver Polarität besitzen. Die RNA-Replikation des Poliovirus findet, wie bei allen Plus-Strang RNA-Viren, in einem membrangebundenen Replikationskomplex statt. Dabei wird durch die virale RNA-Polymerase eine, zum viralen Genom komplementäre, Minus-Strang-RNA synthetisiert, die als Matrize für die Synthese neuer Virus-Genome dient. Die Voraussetzung für den Aufbau des Poliovirus-Replikationskomplex ist die Bildung von Vesikeln im Cytoplasma infizierter Zellen, an deren Membranen die Replikation der viralen RNA initiiert wird. Die Cytopathologie der Poliovirus-Infektion entsteht durch die Akkumulation dieser Poliovirus-Vesikel und ist daher mit der viralen RNA-Replikation gekoppelt. Zur Untersuchung des Ursprungs der Poliovirus-Vesikel und des Mechanismus ihrer Bildung zu den frühen Zeitpunkten der Poliovirus-Infektion wurden in dieser Arbeit sowohl Elektronenmikroskopie, als auch Immunfluoreszenz-Untersuchungen eingesetzt. Dabei wurden Affennierenzellen (BT7-H)untersucht, die entweder uninfiziert, mit Poliovirus infiziert, oder mit Plasmiden transfiziert waren, die für bestimmte Poliovirus-Nichtstrukturproteine codierten. Markerproteine für zelluläre und virale Membranen wurden durch die Analyse optischer Schnittserien im konfokalen Mikroskop lokalisiert. Die Auflösung der konfokalmikroskopischen Aufnahmen wurde durch eine computer-gestützte Methode zur Bildrestaurierung (Dekonvolution) erhöht, mit der die Abbildungsfehler des Mikroskops und die Hintergrundfluoreszenz reduziert werden konnten. Die Dekonvolution ermöglichte es, 3D-Rekonstruktionen von den markierten Strukturen der Zellen zu erstellen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Bildung der Poliovirus-Vesikel sich morphologisch nicht von den zellulären anterograden Transportvesikeln unterscheidet, die durch die COPII-Proteine an den Membranen des endoplasmatischen Retikulums (ER) gebildet werden. Der Marker für die Poliovirus-Vesikel kolokalisierte mit den beiden COPII-Komponenten Sec13 und Sec31 auf den Membranen der Poliovirus-Vesikel. Dies demonstriert, dass die Poliovirus-Vesikel ebenfalls durch den zellulären COPII-Coat an den Membranen des ER gebildet werden. Der für die anterograden Transportvesikel beschriebene Ausschluss der ER-Membranproteine findet auch bei der Bildung der Poliovirus-Vesikel statt. Es konnte weiter gezeigt werden, dass Poliovirus-Vesikel, die durch die Expression des viralen Proteins 2BC oder aller viralen Nichtstrukturproteine im Cytoplasma akkumulierten, ebenfalls COPII-Proteine trugen, also wie die Vesikel in der Poliovirus-Infektion, durch den COPII-Mechanismus gebildet wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Poliovirus-Vesikel an den Membranen des ER homolog zu den anterograden Transportvesikeln durch den zellulären COPII-Mechanismus gebildet werden und nicht durch die Funktion eines viralen Proteins. Poliovirus belongs to the family of Picornaviridae, that consists of non enveloped animal and human pathogenic viruses, that have a singlestranded RNA enome of plus polarity. The RNA replication of Poliovirus, as for all plus strand RNA viruses, takes place in amembrane-bound replication complex. During the RNA replication, the viral RNA polymerase synthesizes an RNA strand of minus polarity,which serves as template for the synthesis of new viral plus strand RNAs. The prerequisite for the formation of the Poliovirus replicationcomplex is the production of vesicles in the cytoplasm of the infected cell that are nessessary for the initiation of the viral RNA replication.The cytopathology of the Poliovirus infection emerges concomitantly with the accumulation of these Poliovirus vesicles and thus is coupledto viral RNA replication. To elucidate the origin of the Poliovirus vesicles and the mechanism of their formation, electron microscopy and immunofluorescenceassays were applied to African reen monkey kidney cells (BT7-H) that were either not infected, infected with Poliovirus, or transfected withplasmids coding for different poliovirus non structural proteins. The localisation of cellular and viral marker proteins was determined by theacquisition of series of consecutive optical sections with a confocal microscope. The resolution of the confocal images was enhanced by asoftware-based method for image restoration that reduces optical aberrations of the microscope and background fluorescence. Thisdeconvolution procedure allows for a 3D reconstruction of the labeled cells in the specimen. In this study, it was shown that the formation of Poliovirus vesicles was - on morphological rounds - similar to the cellular vesicles of theantero rade transport, that were formed at the membranes of the endoplasmic reticulum (ER). The marker for the Poliovirus vesiclescolocalised with both COPII-components Sec13 and Sec31 on the membranes of the Poliovirus vesicles. This shows, that Poliovirusvesicles are formed at the ER membranes by the same mechanism utilizing the cellular COPII coat. The exclusion of ER membraneproteins, that was previously reported for the vesicles of the cellular antero rade transport, was shown to occur with the formation of thePoliovirus vesicles also. Furthermore, it was shown that Poliovirus vesicles that accumulated after either the expression of PV protein 2BCor the entire set of the viral non structural proteins, were also carrying the COPII coat proteins and thus were produced by the COPIImechanism like the vesicles during the poliovirus infection. These results demonstrate that Poliovirus vesicles are formed at the ER membranes by the cellular COPII mechanism homologous to theanterograde transport vesicles and not through the function of a single virale protein.