Molekulare Analyse der G20210A-Mutation in der 3´-untranslatierten Region des Prothrombingens

Abstract

Der G20210A-Polymorphismus im humanen Prothrombingen liegt in der 3'-UTR der mRNA und betrifft das letzte Nukleotid. Die Mutation führt bei Patienten zu einer erhöhten Plasma-Prothrombinkonzentration und zu einer verstärkten Thromboseneigung. Das Thromboserisiko ist für diese Patienten 1,3- bis 6,6-fach erhöht. Die Mutation beeinflusst aufgrund ihrer Lage nicht die Struktur des Proteins. Deshalb wurde postuliert, dass die erhöhte Prothrombinkonzentration bei betroffenen Patienten durch eine verlängerte Halbwertszeit der Prothrombin-mRNA, durch eine verbesserte Transkriptions-, Translations- oder Polyadenylierungseffizienz verursacht wird. Die Aufklärung des zugrunde liegenden Mechanismus ist Voraussetzung für die Entwicklung von therapeutischen Strategien. Zur Untersuchung der Hypothese der mutationsbedingten höheren Stabilität der Prothrombin-mRNA wurden sowohl Wildtyp als auch 20210A 3'-Prothrombinbereich mit 97 bp 3'-UTR und 143 bp 3'-flankierende Region vor das 3'-Poly A-Signal eines beta-Globinreporterplasmids inseriert. Dieses Vektorsystem ermöglicht aufgrund der hohen Halbwertszeit der Globin-mRNA die Messung des Einflusses der 3'-Prothrombinregion auf die Stabilität der Reporter-mRNA. Die G20210A-Mutation an der Polyadenylierungsstelle des Prothrombingens führte in beta-Globinexpressionsstudien und bei rekombinanter Expression in verschiedenen Zelllinien nicht zu einer veränderten Halbwertszeit im Vergleich zur Wildtyp-mRNA. Sowohl die endogene Prothrombin-mRNA als auch beta-Globin-Prothrombin-Hybride wiesen eine hohe Halbwertszeit von 17 bis 50 h in primären Leberzellen und verschiedenen Zelllinien auf. Dabei war die Stabilität der mRNA abhängig von der Art der verwendeten Konstrukte und vom Differenzierungsstatus der Zellen. Die Polyadenylierung erfolgte bei den beta-Globinkonstrukten nicht an der Poly A-Stelle der Prothrombin 3'-Region, sondern ausschließlich an der stromabwärts gelegenen Poly A-Stelle des Reporterplasmids. Nach Exzision der Vektor-Poly A-Stelle war eine unvollständige Prozessierung zu beobachten. Diese Daten weisen auf ein schwaches Polyadenylierungssignal oder auf fehlende cis-regulatorische Elemente in der 3'-Prothrombinregion hin. Die Verlängerung der 3'-flankierenden Prothrombinregion führte zur Reduzierung der Transkriptzahl auf zwei Transkripte, von denen das kleinere vermutlich die korrekt an Position 20210 polyadenylierte mRNA, das größere dagegen die Prä-mRNA oder ein inkorrekt prozessiertes Transkript repräsentierten. Demnach enthält die erweiterte 3'-flankierende Region zusätzliche regulatorische Elemente, die jedoch nicht zu einer 100 %igen Polyadenylierung führen. Der Vergleich von Wildtyp- und 20210A-Transkriptmengen zeigte bei beta-Globinreportersystemen und bei rekombinanter mRNA einen erhöhten Anteil an polyadenylierter mRNA bei der Mutante. Diese Verschiebung zugunsten der korrekt prozessierten und damit für die anschließende Translation funktionellen mRNA führte bei Überexpression der mutierten Variante zu einer gegenüber dem Wildtyp 4-fach erhöhten Proteinkonzentration. Die Insertion der verlängerten 3'-Prothrombinregion in ein Luciferasereportersystem führte in Übereinstimmung mit den zuvor beschriebenen Befunden bei der Mutante zu einer erhöhten Luciferaseaktivität. Alle Daten sprechen dafür, dass der erhöhte Prothrombinplasmaspiegel bei Patienten mit der G20210A-Transition im Prothrombingen durch eine verbesserte Polyadenylierungseffizienz der Prä-mRNA hervorgerufen wird. Der damit verbundene Anstieg der Prothrombin-mRNA-Menge könnte bei Patienten zu einer vermehrten Translation und Proteinbildung führen. Diese Befunde stimmen mit dem bei Mutationsträgern erhöhten Plasmagehalt an Prothrombin überein. Die weitere Untersuchung der beteiligten cis-regulatorischen Sequenzelemente und der daran bindenden Faktoren könnte zu einem besseren Verständnis von Mutationen in der 3'-untranslatierten Region weiterer Gene führen, die eine Erhöhung der mRNA-Menge zur Folge haben und als Grundlage für zukünftige Therapien dienen. The phenotype of the 20210A allele of the prothrombin gene is associated with elevated plasma levels of prothrombin and an increased risk of developing venous thrombosis. Since this mutation is located within the 3' untranslated region of the prothrombin gene, it has been postulated that the mutation might increase the stability of the prothrombin mRNA, the efficiency of transcription or translation or the efficiency of polyadenylation. The half-life of the endogenous prothrombin mRNA was 50 h, measured in rat liver cells and in the human hepatocellular carcinoma cell line HepG2. To study the hypothesis whether the G to A transition at position 20210 of the prothrombin gene affects a regulatory sequence involved in turnover of prothrombin mRNA, the half-life of chimeric globin mRNA containing the 3' untranslated and 143 bp 3' flanking region of prothrombin wild-type or prothrombin mutant was compared. In stably transfected HepG2 and COS-1 cells there was no significant difference in mRNA half-life obtained from the wild-type or mutant prothrombin mRNA. The stability of the chimeric mRNA was dependent on the differentiation of the cells and varied between 17 h and over 50 h. The 3' end cleavage and polyadenylation of the chimeric mRNA didn t occur at the upstream poly (A) site of prothrombin but at the downstream poly (A) site of the reporter plasmid. Excision of the vector poly (A) site resulted in decreased 3' end cleavage efficiency and incorrectly processed mRNAs. This data suggest a weak poly (A) signal of prothrombin or the absence of cis-regulatory elements in the constructs. The extension of the prothrombin 3' flanking region resulted in a reduction of the incorrect processed transcripts, indicating the involvement of downstream cis-acting elements in 3' end cleavage and polyadenylation efficiency. The smaller transcript represented the correct 3' end processed mRNA, whereas the second transcript seemed to be 3' extended and probably arose from read-through at the prothrombin poly (A) site. The comparison of wild-type and G20210A transcript levels indicates increased amounts of correct polyadenylated mutant mRNA. This upregulation of 3' end processing efficiency and greater abundance of functional mRNA caused by the prothrombin G-> A transition led to a 4-fold increase in recombinant protein concentration in stably transfected COS-1 cells. The insertion of the mutant 3' untranslated region and prolonged 3' flanking region of prothrombin additionally contributes to higher luciferase activity levels, probably due to increased polyadenylation efficiency. In conclusion, the elevated plasma prothrombin level in carriers of the prothrombin 20210A allele is probably a result of the improved 3' end cleavage and polyadenylation efficiency and not the result of an increased stability of the prothrombin mRNA.