Die extrazelluläre Endonuklease aus Serratia marcescens : Untersuchungen zur Substratbindung und zur Katalyse

Abstract

Die extrazelluläre Endonuklease aus Serratia marcescens ist aufgrund der Tatsache, daß ihre strukturellen und funktionellen Eigenschaften in den letzten Jahren intensiv erforscht worden sind, zu einem Leitenzym für eine große Gruppe ebenfalls unspezifischer Nukleasen geworden. Daneben existiert vermutlich ein vergleichbarer Katalysemechanismus bei einer Familie von hochspezifischen Homing-Endonukleasen, deren aktive Zentren eine große strukturelle Ähnlichkeit zu dem der Serratia Nuklease aufweisen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden weitergehende biochemische Untersuchungen zur Charakterisierung der Serratia Nuklease durchgeführt, wobei der Schwerpunkt auf der Analyse des Katalysemechanismus sowie der Substratbindung lag. Dazu wurden durch gezielte Aminosäureaustausche Mutanten des Enzyms generiert, als rekombinante Proteine aus E. coli-Kulturen aufgereinigt und anschließend biochemisch untersucht. Anhand der Analyse des pH-Profils und der Metallionenabhängigkeit von Varianten mit Mutationen an der Position 119 wurde bereits vor Bekanntwerden der genauen Struktur der Metall-Koordinationssphäre die essentielle Funktion des Asparagin 119 für die Bindung des Cofaktors herausgestellt. Diese Aminosäure bildet über seine Amidgruppe den einzigen direkten Proteinkontakt zu dem Magnesiumion aus, was eine für Proteine sehr ungewöhnliche Form der Metallionen-Koordinierung darstellt. Die Verbindung Desoxythymidin-di-3´-5´-(p-nitrophenyl)-phosphat wurde als neues artifizielles Minimalsubstrat der Serratia Nuklease etabliert, nachdem die genaue Spaltposition innerhalb dieser Verbindung bestimmt worden war. Mit diesem Substrat kann unter anderem die strukturelle Integrität der aktiven Zentren neu generierter Nuklease-Varianten überprüft werden, da herausgestellt wurde, daß Mutationen an Aminosäuren, die nicht direkt das aktive Zentrum bzw. die essentiellen Aminosäuren His89 und Asn119 betreffen, auf die Umsetzung von Desoxythymidin-di-3& #61602;-5& #61602;-(p-nitrophenyl)-phosphat keine Auswirkungen haben. Weiterhin wurde mit Hilfe dieses Substrates das lange Zeit umstrittene Modell gestützt, bei dem das Histidin 89 während der Katalyse die Funktion der allgemeinen Base übernimmt, da aufgrund eines sehr niedrigen pKa-Wertes der Abgangsgruppe eine Säure für die Hydrolyse von Desoxythymidin-di-3´-5´-(p-nitrophenyl)-phosphat entbehrlich ist, die Mutante H89A dieses Substrat jedoch nicht spaltet. Bis heute liegt keine Kristallstrukturanalyse für die Serratia Nuklease im Komplex mit einem Substrat vor, so daß wenig über die Art der Bindung einer Nukleinsäure bekannt ist. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb die mögliche Beteiligung von 11 basischen und 2 aromatischen Aminosäuren, die die vermutete Substratbindungstasche des Enzyms bilden sollten, untersucht. Dazu wurden mittels PCR-Mutagenese Alaninmutanten dieser Aminosäurereste generiert, die hinsichtlich ihrer Fähigkeit, hochmolekulare DNA sowie verschiedene kurze Substrate zu hydrolysieren, und in bezug auf die Spaltung überspiralisierter Plasmid-DNA analysiert wurden. Substrate mit einer abasichen site wurden eingesetzt, um die Mutanten der aromatischen Aminosäuren Tyr76 und Trp123 zu untersuchen. Ausgehend von den genannten Experimenten wurde ein Modell der Nukleinsäure-Bindung der Serratia Nuklease über multiple Substratbindungsstellen erarbeitet, bei dem sieben basische Aminosäuren an der Ausbildung von Phosphatbindungsstellen beteiligt sind, und aromatische Reste möglicherweise mit den Basen einer gebundenen Nukleinsäure in Kontakt treten.