Untersuchungen zu möglichen Bindungs- und Aktivierungsfaktoren der zellulären Immunantwort bei Manduca sexta L.

Abstract

Wirksame bakterielle Provokatoren des Immunsystems von Manduca sexta sind neben Escherichia coli und Bacillus megaterium auch Zellwandmaterial und Peptidoglukanfragmente < 10 kDa von Micrococcus luteus. Die Hämolymphe von unbehandelten M. sexta-Larven weist unterschiedliche z. T. ausreichende bakteriolytische Aktivitäten auf, um Bakterien mit Peptidoglukan des Lys-Typs sehr schnell zu lysieren. B. megaterium wurde sowohl von Plasmatozyten als auch von Granulären Zellen der M. sexta-Larven phagozytiert. Kurz nach der Injektion von B. megaterium bildeten sich zunächst Aggregate aus Bakterien und überwiegend Plasmatozyten, aber auch Granuläre Zellen waren beteiligt. Plasmatozyten waren in solchen Fällen kaum noch frei zirkulierend zu finden. Im Laufe der Zeit erhöhte sich die Zahl der freien Plasmatozyten wieder.Darüber hinaus wurden durch Affinitätspräzipitation Hinweise für das Vorhandensein von Bindungsproteinen für Gram-positive Bakterien, mögliche peptidoglycan recognition proteins (PGRPs), in der zellfreien Hämolymphe von M. sexta-Larven gefunden. Sie weisen ein relatives Molekulargewicht von ca. 20 k auf. Mittels des Screenings von cDNA-Expressionsbanken aus Hämozyten bzw. Fettkörpern von induzierten M. sexta-Larven mit monoklonalen Antikörpern (gegen M. sexta-Hämozyten) wurden Klone detektiert, die für Sequenzen eines neuen M. sexta-Annexin IX bzw. Annexin B9 kodieren. Es weist eine große Ähnlichkeit auch bezüglich der Struktur des Gens mit dem bereits bekannten Annexin IX von Bombyx mori auf. Es liegt ebenfalls mit drei Isoformen vor, die sich in einem kurzen 16 Aminosäuren langen C-terminalen Stück unterscheiden. Die drei Isoformen entstehen vermutlich aus einem einzigen Gen durch alternatives Spleißen der C-terminalen Region (alternative 3 -Spleißstellen). Annexin IX konnte immunhistologisch sowohl im Fettkörper als auch in Hämozyten, nicht jedoch in der Hämolymphe von M. sexta-Larven nachgewiesen werden. Das relative Molekulargewicht liegt bei ca. 33 34 k. Ein Signalpeptid liegt nicht vor. Es konnten gleichwohl verschiedene Domänen bzw. Motive in der Aminosäuresequenz detektiert werden: N-Glykosylierungs-, Myristylierungs- und verschiedene Phosphorylierungsmotive, die für Annexine typischen Annexin-Domänen und eine Calciumbindungsstelle sowie ein KGD-Motiv. Im Rahmen eines EST-Projekts der Hämozyten-cDNA-Bank aus M. sexta konnten verschiedene Sequenzen ermittelt werden, die Proteine kodieren, die am Immungeschehen und an der Individualentwicklung beteiligt sind. Sie kodieren außerdem Strukturproteine, Enzyme und Proteine, die an Nukleinsäuren binden. Zu einigen der EST-Squenzen konnten keine vergleichbaren Sequenzen bzw. nur solche mit geringer Übereinstimmungswahrscheinlichkeit in Datenbanken gefunden werden, so dass hier das Potenzial für Sequenzen neuer noch nicht entdeckter Protein bei M. sexta liegt. Cell wall as well as peptidoglycan fragments (< 10 kDa) of Micrococcus luteus are as usefull as whole bacteria like Escherichia coli or Bacillus megaterium, respectively, to provocate the immunsystem of Manduca sexta larvae. Antibacterial activity in the hemolymph of untreated larvae is sufficient to lyse bacteria with Lys-type peptidoglycan quickly.After injection of B. megaterium in M. sexta larvae aggregates of bacteria and hemocytes, mainly plasmatocytes but also granular cells, were observed. At this timepoint only few circulating plasmatocytes could be detected, but after a while number these plasmatocytes increases again. B. megaterium was phagocytosed by plasmatocytes as well as by granular cells. There are indications for gram-positive binding proteins (approx. 20 kDa) like peptidoglcycan recognition proteins (PGRPs) in the hemolymph of M. sexta larvae. The proteins were detceted with affinity precepitation.Two cDNA-expression libraries from hemocytes and from fatbody, respectively, of induced M. sexta larvae were screened with monoclonal antibodies (against M. sexta hemocytes). Clones were detected coding for sequences of a new M. sexta-annexin IX or annexin B9, respectively. There is a great similarity with known Bombyx mori annexin IX, even in gene structure. Like B. mori-annexin IX the M. sexta-annexin IX is existing with three isoforms differing only in last 16 amino acids in C-terminal region. It is believed that the three isoforms are generated from one gene by alternative 3 -splicing in C-terminal region. Annexin IX was detected in hemocytes as well as in fat body, but not in hemolymph of M. sexta larvae with a relative molecular weight of about 33 34 k. There was no indication for a signal peptide in the sequence, but for several other motives like N-glycosylating, myristoylating, and different phosphorylating motives, typical annexin domains, a calcium binding site, and a KGD-motif. Within an EST-project of the hemocyte cDNA-library of M. sexta sequences were found coding for proteins of the immune system and of developmental processes. In addition these proteins are structure elements of the cell, they are enzymes or nucleic acid-binding proteins. Some of the sequences don t code for any known sequence or have only small similarities to known sequences, so that there is possibility for new sequences of unknown proteins of M. sexta.