Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von redoxaktiven Proteinen des Malariaparasiten Plasmodium falciparum

Abstract

Aufgrund zunehmender Verbreitung der Erreger und wachsender Resistenzen werden neue Medikamente gegen Malaria dringend benötigt. Der Erreger der tropischen Malaria, Plasmodium falciparum, ist während seiner Vermehrung in menschlichen Erythrozyten einer enormen oxidativen Belastung ausgesetzt. Aufgrund dessen wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit das antioxidative System des Parasiten untersucht, dessen Bestandteile als Zielmoleküle für die rationale Medikamentenentwicklung von Bedeutung sind. Da Katalase und Glutathionperoxidase in Plasmodium fehlen, spielen die auf den NADPH-abhängigen Flavoenzymen Thioredoxinreduktase (TrxR) und Glutathionreduktase (GR) basierenden Systeme eine besondere Rolle. Hier konnte eine alternative Spleissvariante der TrxR-mRNA identifiziert werden, die analog zu den humanen Formen, Regulations- oder Targetingfunktion haben könnte. Einige putativ inhibitorische Verbindungen der TrxR wurden erfolgreich getestet, wobei die Spezifität für das Pf-Enzym herauszustellen ist. An Plasmodium-Kulturen wurden IC50-Werte im niederen mikromolaren Bereich für drei Substanzen bestätigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Proteine mit Trx-Aktivität (Trx2 und 3) und zwei weitere Trx-ähnliche Proteine (Tlp1 und 2) identifiziert, kloniert und exprimiert. Das Tlp1 ist wahrscheinlich regulatorischer Bestandteil des Dyneinmoleküls und somit für den intrazellulären Transport von Bedeutung. Tlp2 besitzt das active site-Motiv CPAC und ist evtl. membranständig oder im Mitochondrium lokalisiert. Die beiden neu identifizierten Trx-Proteine Trx2 und Trx3 sind Substrate der TrxR und werden aktuellen Vorhersagen zufolge in den Apicoplasten transferiert.Für die bislang als klassische Thioredoxinperoxidase bekannte PfTPx1 wurde im Rahmen dieser Arbeit Aktivität mit Glutaredoxin (Grx) gezeigt. Ferner wurde der Reaktionsmechanismus der TPx1 anhand von Cystein-Alanin-Austausch-Mutanten (C74A, C170A) untersucht, wobei sich insbesondere C170 als für die Trx-abhängige Aktivität bedeutsam erwies. Ebenfalls mit beiden Thiolproteinen aktiv ist das hier neu identifizierte Antioxidative Protein (AOP), ein Peroxiredoxin vom TypV. AOP reduziert u.a. Phosphatidylcholinhydroperoxid und stellt damit die erste Pf-Peroxidase zur Entgiftung von Lipidhydroperoxiden dar. Die Untersuchung der subzellulären Lokalisation zeigte das AOP1-66GFP-Fusionsprotein im ER von Toxoplasma gondii, obwohl in silico-Vorhersagen Apicoplast-Targeting indizierten. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, röntgentaugliche Kristalle von PfAOP zu züchten. Die Röntgenstrukturanalyse zeigte, dass AOP nativ als nicht-kovalentes Dimer vorliegt und mechanistisch ein 1-Cys-Prx darstellt. Anhand von Vergleichen mit anderen Prx-Strukturen kann ein charakteristischer Prx-fold beschrieben werden. Hochkonservierte AS-Reste, welche die active site bilden, finden sich auch in AOP. Verschiedene Interaktionstests bekannter Pf-Proteine ergaben, dass Trx1 und Grx Liponsäure bzw. Liponamid reduzieren. PfTrxR zeigt ebenfalls schwache LA-/LAM-Reduktase-Aktivität; diese Eigenschaft ist demnach nicht zwingend an ein Selenocystein gebunden. Wasserstoffperoxid wird von Trx1 umgesetzt, jedoch nicht von Grx. Trx1, Grx, TPx1 und auch Plasmoredoxin (Plrx), ein für Plasmodium spezifisches Redoxprotein, können Dehydroascorbat reduzieren. Plrx regeneriert darüber hinaus TPx1 und AOP.Schließlich wurde eine Hemmung von TrxR, Grx und GR durch Ferriprotoporphyrin IX (FP), einem Produkt des parasitären Hämoglobinabbaus, gezeigt. Da die Empfindlichkeit der PfGR jedoch deutlich geringer war als die der anderen untersuchten Redoxproteine und v. a. des glycolytischen Schlüsselenzyms Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase wird postuliert, dass bei beginnender FP-Toxizität zunächst die Glycolyse gedrosselt wird, um Glucose in den Hexosemonophosphatweg zu schleusen und somit NADPH zur Entgiftung von FP und reaktiven Sauerstoffspezies verfügbar zu machen. Insgesamt konnte im Rahmen dieser Arbeit das Verständnis des komplexen Redoxsystems von Malariaparasiten vergrößert werden. Es wurde ein Beitrag zur Strukturaufklärung möglicher Zielmoleküle der Medikamentenentwicklung geleistet, und verschiedene Inhibitorverbindungen wurden charakterisiert. Der Kenntnis des Wirkmodus gängiger Antimalaria-Substanzen wie Chloroquin, die die Steigerung der FP-Toxizität beinhaltet, wurden durch die hier erzielten Resultate neue Aspekte hinzugefügt. Plasmodium falciparum (Pf), the cause of tropical malaria, is under enormous oxidative stress. Antioxidative defence systems thus make up promising drug targets. Because Plasmodium obviously lacks catalase and glutathione peroxidase, the systems around thioredoxin and glutathione should be of particular importance. These thiols are regenerated NADPH-dependently by the flavoenzymes thioredoxin reductase (TrxR) and glutathione reductase (GR). Here we identified an alternative transcript variant of PfTrxR with an N-terminal extension, which might have signaling or regulatory function. Several putative inhibitors, which were tested here on Plasmodium and human TrxR revealed promising specificity for the parasitic enzyme and were also effective on parasite cultures. Four Plasmodium proteins (Trx2, Trx3, Tlp1, Tlp2) with a thioredoxin-like motif were identified, cloned and heterologously expressed. Two of them can be reduced by PfTrxR and are therefore named PfTrx2 and 3. Both are predicted to be apicoplast-targeted. Thioredoxin-like protein 1 is thought to mediate redox regulation of dynein. For PfTrx1 and PfGrx it was shown here, that they can reduce lipoamide and lipoic acid, respectively, as well as dehydroascorbic acid. PfTrx1 furthermore detoxifies hydroperoxides. PfTPx1, a typical 2-Cys peroxiredoxin, was found to be regenerated not only by Trx but also Grx. Alanin mutants of the cysteines Cys74 and Cys170 of TPx1 proved that Cys170 is involved in disulfide formation and thus important for acceptance of Trx as electron donor. Moreover, a new peroxiredoxin was identified and named AOP for antioxidant protein. It is reduced by Trx and Grx, respectively, and is the first Pf peroxidase which detoxifies lipid hydroperoxides. A fusion of the putative leader sequence of AOP with GFP was found to be targeted to the ER of Toxoplasma gondii tachyzoites, although AOP was highly predicted to be apicoplast-localized. Crystals were obtained from AOP, and X-ray structure was solved at 1.8 Å resolution. Despite sequence similarities with atypical 2-Cys Prx AOP is mechanistically a 1-Cys Prx and is present as non-covalently linked dimer. AOP harbours the catalytic triade conserved in Prx and shows the common Prx fold. AOP as well as TPx1 can be regenerated by plasmoredoxin, a redox protein specific for Plasmodium parasites, which also reduces dehydroascorbate.Finally we investigated the inhibition of Pf redox enzymes by ferriprotoporphyrin IX (FP), a parasitotoxic product of hemoglobin digestion. PfGR was found to be more resistant than GR proteins from other organisms. On the other hand, PfTrxR was quite susceptible for inhibition by FP. Because of the very low IC50 for the glycolytic enzyme glyceraldehyde dehydrogenase we propose a downregulation of parasitic glycolysis as regulatory mechanism to cope with increasing FP levels. This would pass a greater part of glucose through the hexosemonophosphate shunt and thus provide reduction equivalents for glutathione regeneration and therefore FP detoxification. Inhibition of Trx and Grx system might belong to the toxic effects of rising FP levels. Because Malaria is still spreading and resistances against common antimalarials like chloroquine increase, new drugs are urgently needed. The redox systems of Plasmodium falciparum harbour interesting drug targets This work contributes to the knowledge of these systems by identification of components and interactions. Mechanistical and structural analysis of potential target molecules may serve as basis for rational drug development. Promising specific inhibitors of PfTrxR were characterized and mechanisms of FP toxicity and detoxification were investigated. Chloroquine, for example, acts at least partly by increasing FP toxicity, thus knowledge of FP metabolism is important to overcome resistances.