Das Selenoprotein Thioredoxinreduktase : funktionelle und strukturelle Charakterisierung von humanen Disulfidreduktasen als potentielle Zielmoleküle von Chemotherapeutika

Abstract

Die im Säugerorganismus als Selenocystein-haltiges Enzym vorkommende homodimere Thioredoxinreduktase ist zusammen mit der Glutathionreduktase zentraler Bestandteil des zellulären Thiolmetabolismus, der über die antioxidative Abwehr hinaus auch an der Redoxregulation intra- und extrazellulärer Prozesse beteiligt ist. Das Thioredoxin- und das Glutathionsystem arbeiten in verschiedenen Organismen als parallele, sich ergänzende oder aber auch als sich ersetzende Systeme. In der vorliegenden Dissertation wurden verschiedene Beiträge zur biochemischen und kristallographischen Charakterisierung der Flavoproteine Thioredoxinreduktase und Gluta-thionreduktase im Hinblick auf ihr Potential als Zielmoleküle neu entwickelter Disulfid-reduktaseinhibitoren geleistet. Die Inhibitorstudien wurden durch Studien an verschiedenen TrxR-Mutanten, weiterführenden differentiellen Genom- und Proteomanalysen sowie Studien am Tiermodell komplementiert. Für die TrxR-Studien wurden rekombinante und native TrxR aus humaner Plazenta verwendet. Zur Gewinnung der nativen TrxR aus Plazenta wurde ein etabliertes Aufreinigungsverfahren angewendet und weiter optimiert. Im heterologen System konnten TrxR-Mutanten ohne Selenocystein in ausreichenden Mengen exprimiert werden. Diese bestanden in einer am C-terminalen Selenocystein mutierten TrxR-Mutante sowie in anderen, C-terminal-verkürzten TrxR-Mutanten und wurden auf Substratspezifität und Katalyse-eigenschaften untersucht. Trotz ihrer homologen Bereiche in den Substratbindungsregionen sind die TrxR und GR nicht ineinander zu überführen. Die Cysteinmutante der hTrxR wurde vergleichend zum Selenocystein-Wildtyp charakterisiert. Trotz einer sonst geringen Aktivität mit den üblichen Substraten Trx und DTNB erwies sie sich als potentes Enzym in der Menadionreduktion (kcat/KM = 7.4 ± 1.5 · 106 M-1· min-1) in vitro und im Zusammenhang mit einem induzierten Lipid-Transfer in die Zelle als apoptoseauslösend. Die Kristallisation der humanen TrxR stand ebenfalls im Mittelpunkt dieser Dissertation. Es gelang, hochwertige Einkristalle der Cysteinmutante der TrxR zu produzieren, von der erste Röntgenstrukturdaten bis 2.9 Å gewonnen werden konnten. Die erste im Rahmen der vorliegenden Arbeit getestete Inhibitorklasse setzte sich aus an Nitrofurancarbonhydrazid gekoppelten Cis-Diamindichlorplatin-Komplexen (CDDP-Kom-plexe) zusammen. Die CDDP-Komplexe erwiesen sich in enzymatischen in vitro-Unter-suchungen als irreversible und selektive Inhibitoren der NADPH-reduzierten TrxR im nanomolaren Konzentrationsbereich, mit maximalen Geschwindigkeitskonstanten ki um 1 min-1 in Kinetiken pseudo-erster Ordnung. Zellkulturexperimente und DNA-Interaktions-studien bestätigten, dass die TrxR-Hemmung der CDDP-Komplexe einen bedeutenden Beitrag zur Toxizität in Tumorzellen leisten kann (Millet et al., 2005). Die bekannten in vitro-Eigenschaften der Inhibitorklasse der 2,2':6',2''-Terpyridinplatin(II)-Komplexe sollten in dieser Dissertation in vivo in einem Glioblastom-Rattenmodell untersucht werden. Die in Zusammenarbeit mit dem Universitätsklinikum Heidelberg durchgeführten Tierversuchsreihen mit verschiedenen Therapiemodellen und MRI-Aus-wertungen wurden durch Messungen verschiedener biochemischer, insbesondere redox-chemischer Parameter in den Geweben der Ratten ergänzt. Es ergaben sich gewebe-spezifische Veränderungen in der Redoxaktivität mit einer spezifischen TrxR-Hemmung im Tumorgewebe, die aber nicht mit der Auslösung der apoptotischen Kaskade einhergingen. Genom- sowie Proteomanalysen von behandelten Glioblastomzellen weisen auf einen chemotherapeutisch induzierten Zellzyklusarrest hin. (Urig et al., 2005; Ahmadi et al., 2005). Das Inhibitorpotential zweier Platin- und zweier Goldphosphol-Komplexe konnte in intensiven Kinetikstudien an der TrxR und der GR bestätigt werden, mit einer deutlichen Präferenz der Platin-Phospholkomplexe für die TrxR. Gold-Phospholkomplexe sind sehr effiziente Inhibitoren beider Disulfidreduktasen im unteren nanomolaren Bereich und gehen nach einer ersten kompetitiven Kinetik sehr schnell in die irreversible Phase zur kovalenten Modifikation der Enzyme über. Es gelang im Rahmen dieser Arbeit, einen hGR-Phosphol-Komplex zu kristallisieren und seine Röntgenstruktur bei 2.6 Å zu lösen. Die lineare S-Au-S-Geometrie zwischen den Cysteinen im aktiven Zentrum der hGR konnte zum ersten Mal in einer Proteinstruktur beobachtet werden (Urig et al., in press; Koncarevic et al., 2005; Deponte et al., 2005). The mammalian selenocystein containing homodimeric enzyme thioredoxin reductase (TrxR) is, together with glutathione reductase (GR), one of the two major proteins of the cellular thiol metabolism. It is involved in the antioxidant defence and is responsible for the redox regulation of intracellular and extracellular processes. The thioredoxin and the glutathione system can act as parallel, complementary or even substituting systems, depending on the organism. The present thesis describes the biochemical as well as crystallographic characterization of the two flavoproteines thioredoxin reductase und glutathione reductase as potential targets for novel inhibitors of disulfide reductases. The inhibitory studies were complemented by studies with different mutants of TrxR and additional differential genome and proteome analyses. Therefore, recombinant as well as native TrxR were used. The native enzyme was prepared from human placenta, using an established purification protocol that was further optimized. The hTrxR mutants without selenocystein were heterologously expressed in sufficient amounts. A cystein mutant as well as a C-terminally truncated mutant of hTrxR were examined for their substrate specificities and catalytic properties. Despite sequenz and structure homology, particularly in the substrate binding regions, it is not possible to transfer the TrxR into a GR by C-terminal protein engineering. The cystein mutant of hTrxR was much less active than the wildtype enzyme in reaction with the two common substrates thioredoxin and DTNB. For the first time, it could be shown that this mutant is very active with menadione in vitro (kcat/KM = 7.4 ± 1.5 · 106 M-1· min-1) and is capable to induce apoptosis when introduced in the cell by a lipid-mediated delivery system. The crystallization of human TrxR was another focus in this thesis. High quality monocrystals of the hTrxR cystein mutant were obtained which diffracted to 2.9 Å (X-ray struture analysis). In the first inhibitor study different cis-diaminedichlorplatinum(II) complexes from nitro-furancarbohydrazide (CDDP complexes) were examined. It was shown in in vitro assays that the CDDP complexes are irreversible and selective inhibitors of the NADPH-reduced TrxR in the nanomolar range with maximal rate constants ki of around 1 min-1 in pseudo-first order kinetics. Cell culture experiments and DNA interaction studies confirmed that the inhibition of TrxR by the CDDP complexes contributes to the toxicity of tumor cells (Millet et al., 2005). 2,2':6',2''-terpyridineplatininum(II) complexes, known for their good inhibitory potential in in vitro assays, were tested for their in vivo activity in a glioblastoma rat model. In cooperation with the university hospital in Heidelberg a set of animal experiments including different therapy models was realised and analysed by MRI. In addition, several biochemical and redox parameters were determined in the rat tissues. Tissue-specific variations in redox activity were observed with a specific inhibition of TrxR in the tumor tissue, not inducing the apoptotic cascade. The results from genome and proteome analysis of treated glioblastoma cells furthermore indicate a chemotherapeutically induced cell cycle arrest. (Urig et al., 2005; Ahmadi et al., 2005). The inhibitory potential of two platinum and two gold phosphole complexes was proved in extensive kinetic analyses using TrxR and GR. The platinum complexes showed a strong preference for TrxR while the gold phosphol complexes are very efficient inhibitors of both enzymes in the lower nanomolar range. After a first competitive kinetic a fast and irreversible phase is followed to yield the covalent modification of the enzyme. We succeded in crystallisation of hGR in complex with a gold phosphol inhibitor and the X-ray structure was solved at 2.6 Å. The linear S-Au-S geometry between the cysteines in the actice site of hGR is the first to be observed in a protein structure (Urig et al., in press; Koncarevic et al., 2005; Deponte et al., 2005).