Untersuchungen zum Resistenzmechanismus der Gerste (Hordeum vulgare L.) gegenüber dem Gerstenmehltaupilz (Blumeria graminis f. sp. hordei)

Abstract

WRKY-Transkriptionsfaktoren bilden eine Multigenfamilie mit mindestens 81 Mitgliedern in Reis. Sie binden an so genannte W-Boxen, die vor allem in Promotoren von Genen der Pathogenantwort und senseszenzassoziierten Genen gehäuft auftreten. Bisher sind nur zwei WRKY-Faktoren aus Gerste, SUSIBA2 und HvWRKY1, charakterisiert worden. In dieser Arbeit konnten contigs von 27 weiteren möglichen WRKY-Faktoren aus Gerste in silico identifiziert werden. Davon wurden vier Fragmente und eine vollständige Sequenz kloniert. Es wurde gezeigt, dass sechs von zehn contigs nach Inokulation mit Blumeria graminis f. sp. hordei (Bgh) zu frühen Zeitpunkten induziert werden. Detaillierte Studien wurden mit HvWRKY1 und HvWRKY2, dessen Sequenz aus der GenBank EST-Datenbank gewonnen wurde, durchgeführt. HvWRKY1 und 2 besitzen zu 51 % identische Aminosäuren. Das biphasische Muster der Expressionssteigerung beider Gene nach Bgh-Inokulation unterschied sich nur geringfügig zwischen Ingrid Wildtyp und drei Kultivaren, die eine Mutation im Signalweg von Mlo bzw. Ror1 aufwiesen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Expression verschiedener WRKY-Faktoren in Gerste nach Inokulation mit dem Echten Weizenmehltau, mit Fusarium graminearum und nach Verwundung erhöht war. Die Untersuchung der Expression in verschiedenen pflanzlichen Organen zeigte, dass HvWRKY1 und 2 in allen Geweben exprimiert werden, allerdings am stärksten in Blättern. HvWRKY2-mRNA akkumuliert außerdem in reproduktiven Geweben. Die Analyse der ersten 1,9 kb des Promotors von HvWRKY1 ergab, dass dieser sechs vollständige W-Boxen enthält. Diese Anreicherung lässt darauf schließen, dass sie funktionell sind. Mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie konnte nachgewiesen werden, dass GFP:Fusionskonstrukte beider Gene unabhängig von einer Inokulation mit Bgh konstitutiv im Zellkern lokalisiert sind. Die Bedeutung von HvWRKY1 und 2 für die Interaktion von Gerste und Bgh zeigt sich dadurch, dass beide Gene in transienten Transformationsexperimenten als Suszeptibilitätsfaktoren wirkten. Sie waren allerdings nicht in der Lage, die mlo-vermittelte Resistenz zu brechen. Transgene HvWRKY1-RNAi Pflanzen zeigen bisher keinen deutlichen Phänotyp. RNA-Interferenz Experimente mit anderen durch Bgh induzierten Genen demonstrierten, dass der knock-down einer receptor-like protein kinase (RLK) zu erhöhter Resistenz und der mitogen activated protein kinase (MAPK) zu gesteigerter Anfälligkeit führten. WRKY-transcription factors form a large multigene family of at least 81 members in rice. They bind to so called W-boxes, clustered in promoters of defence-related and senescence-associated genes. Until now, only two WRKY-factors from barley, SUSIBA2 and HvWRKY1, have been characterized. Here, contigs of 27 additional putative WRKY-factors from barley could be identified in silico. Out of these, four fragments and one full length gene has been cloned. Six of ten contigs are part of the immediate early response to Blumeria graminis f. sp. hordei (Bgh). The biphasic expression pattern of the induction of HvWRKY1 and 2 after inoculation with Bgh did not differ between cv. Ingrid wildtype and three cultivars containing a mutation in the Mlo- and Ror1-signaling pathway. Besides this fact, the expression of several WRKY-factors was enhanced after inoculation with the inappropriate wheat powdery mildew (Bgt), Fusarium graminearum and after wounding. HvWRKY1 and 2 are expressed in all investigated barley organs but strongest in leaves. HvWRKY2 mRNA additionally accumulated in reproductive tissues. Analysis of the first 1,9 kb of the HvWRKY1 promoter revealed six complete W-boxes which is a clear accumulation compared to the estimated average occurence. Nuclear localisation of HvWRKY1 and 2 GFP:fusion constructs was shown by confocal laserscanning microscopy to be independent of inoculation with Bgh. The significance of HvWRKY1 and 2 in the interaction of barley and Bgh is emphasized by their effect as factors of susceptibility in a transient transformation assay. Both genes were not able to break mlo-mediated resistance. Transgene HvWRKY1-RNAi plants showed until now no clear phenotype. RNA-interference experiments with other Bgh-responsive genes demonstrated an increase in resistance after knock-down of a receptor-like protein kinase (RLK) and a decrease for a mitogen activated protein kinase (MAPK).