Charakterisierung und Modulation der porenbildenden, hämolytischen und Invasions-vermittelnden Wirkung von Listeriolysin O aus Listeria monocytogenes

Abstract

Das cholesterolabhängige Zytolysin Listeriolysin O (LLO) ist ein essentieller Pathogenitäts­faktor des grampositiven Bakteriums Listeria (L.) monocytogenes und erfüllt im Verlauf einer Infektion verschiedene wichtige Funktionen. Dazu gehören die Induktion verschiedener Zellreaktionen bei sublytischen LLO-Konzentrationen und die Lyse von zellulären Membranen bei hohen LLO-Konzentrationen. Diese Wirkungen werden größtenteils durch die von LLO gebildeten Membranporen vermittelt. Die vorliegenden Arbeit beschäftigt sich in erster Linie mit der Charakterisierung der Eigenschaften dieser Poren. Weitere Schwerpunkte sind die Untersuchung der lytischen Wirkungvon LLO und seiner Bedeutung für die Invasion von L. monocytogenes in Wirtszellen. Ein besonderes Merkmal der LLO-Poren, die mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik an HEK293-Zellen untersucht wurden, ist das Auftreten von Porenschlüssen. Diese Schlüsse waren in der zellfreien Outside-Out-Konfiguration seltener und bei menschlichen Erythrozyten fast gar nicht zu beobachten. Sie beruhen demnach vermutlich auf einer endozytotischen Elimination der Poren von der Oberflächenmembran. Dieser Elimnations­prozess ist offensichtlich stark von dem durch die LLO-Poren vermittelten Calcium-Einstrom abhängig und wird durch eine Destabilisierung des Aktin-Zytoskeletts erleichtert. Es ist bekannt, dass bei der Befreiung von L. monocytogenes aus dem Phagosom von Wirtszellen neben LLO zwei von den Listerien sezernierte Phospholipasen C von Bedeutung sind. Mit Hilfe einer Deletionsmutante, die diese Enzyme nicht exprimiert, konnte jedoch gezeigt werden, dass die listeriellen Phospholipasen C zumindest extrazellulär keinen Einfluss auf die Porenbildung haben. Es zeigte sich, dass zur Hämolyse etwa 10-fach höhere LLO-Konzentrationen erforderlich sind als zur sublytischen Porenbildung. Die hämolytische Wirkung cholesterolabhängiger Zytolysine lässt sich charakteristischerweise durch Thiole und andere reduzierende Agenzien verstärken. Mit Hilfe von Patch-Clamp-Experimenten konnte auch eine Aktivierung sublytischer LLO-Poren nachgewiesen werden. Die Verstärkung des LLO-induzierten Ladungsflusses über die Zellmembran in Anwesenheit von Thiolen ist nur teilweise durch das vermehrte Auftreten hoher Porenstromamplituden zu erklären. Als weiterer Faktor ist eine Verlängerung der Porenoffenzeiten in Betracht zu ziehen. Möglicherweise ist die Thiol-Aktivierbarkeit wichtig für die kompartimentspezifische Wirkung von LLO. Am Modell menschlicher Larynxkarzinomzellen konnte die Invasion von L. monocytogenes durch Zugabe von Thiolen erhöht werden. Daher ist denkbar, dass physiologische oder pharmakologische Erhöhungen der Thiol-Konzentration im Plasma die Pathogenität von L. monocytogenes verstärken. Aufgrund der hohen Bedeutung von LLO-Poren für die Pathogenität von Listerien stellt deren Verhinderung oder Blockade einen vielversprechenden Ansatz zur Therapie von Listerieninfektionen dar. In der vorliegenden Arbeit gelang es, die LLO-Porenbildung an HEK293-Zellen durch Vorinkubation mit nanomolaren Konzentrationen des Polypeptids Protamin nahezu vollständig zu blockieren. Auch die hämolytische Aktivität von LLO ließ sich auf diese Weise unterbinden. In Invasionsexperimenten wurde belegt, dass die Hemmung der Porenbildung auch einen wirksamen Schutz vor der Invasion von L. monocytogenes in Wirtszellen bietet. Der Wirkmechanismus von Protamin beruht offensichtlich in erster Linie auf einer Wechselwirkung mit der Zelle. Allerdings scheint Protamin die Invasion zusätzlich auch über einen porenunabhängigen Mechanismus zu beeinflussen und hemmt selbst die Invasion LLO-defizienter Mutanten. Da Protaminsulfat die Invasion ebenso eindrucksvoll verhinderte und für diese Substanz bereits pharmakotherapeutische Erfahrungen am Menschen vorliegen, lassen diese Ergebnisse auf einen möglichen klinischen Nutzen bei Listerieninfektionen hoffen. The cholesterol dependent cytolysin listeriolysin O (LLO) is an essential virulence factor of the gram-positive bacterium Listeria (L.) monocytogenes and fulfills various important functions during the infection process. These include induction of multiple cell reactions at sublytic LLO-concentrations and lysis of cellular membranes at high LLO-concentrations. Most effects are mediated by membrane pores that are formed by LLO. A major topic of the present work is the characterization of the properties of these pores. Further central points are the lytic effect and the relevance of LLO for the invasion of L. monocytogenes into host cells. A special feature of LLO-formed pores, which were investigated on HEK293 cells with the patch clamp technique, is the occurrence of pore closings. These closings however were rare in the cell-free outside& #8209;out configuration and almost absent in experiments with human red blood cells. Thus they seem to be due to an endocytic eliminiation of the pores from the cell membrane. This elimination process obviously depends strongly on calcium influx through the LLO-formed pores and is facilitated by a destabilization of the actin cytoskeleton. Further to LLO, two phospholipases C secreted by L. monocytogenes are known to be involved in the escape of listeria from the phagosome. With a deletion mutant that does not express these enzymes, we were able to show that the listerial phospholipases C do not have an impact on pore formation, at least from the extracellular side of the membrane. We found that hemolysis requires about 10-fold higher LLO-concentrations compared to those needed for sublytic pore-formation. The hemolytic effect of cholesterol dependent cytolysins can characteristically be enhanced by thiols and other reducing agents. The present work shows that thiol-activation already happens on the level of sublytic pore-formation. The observed enhancement of the LLO-induced transmembrane charge flow in presence of thiols can partly be explained by a more frequent occurrence of high pore current amplitudes. Prolonged open times must be taken into account as a further important factor. Thiol-activation might be important for the specific action of LLO in different compartments. Using human larynx carcinoma cells as an invasion model, we found that the invasion rate of listeria in host cells was enhanced in the presence of thiols. Physiological or pharmacological elevations of the plasma thiol-concentrations might thus lead to a higher pathogenicity of L. monocytogenes. Because of the high relevance of LLO-formed pores for the pathogenicity of listeria, the prevention or blockade of the pores constitutes a promising therapeutical approach for listerial infections. In the present work pore-formation in HEK293 cells by LLO was successfully blocked by preincubation of the cells with nanomolar concentrations of the polypeptide protamine. By this means, hemolysis of sheep red blood cells of LLO was also prevented. Furthermore, the inhibition of pore-formation by protamine provided an effective protection from invasion of L. monocytogenes into host cells. Protamine action is obviously due to interaction with the cell. But additionally, protamine seems to influence invasion in a pore-independent way and therefore even inhibits invasion of LLO-deficient mutants. Protamine sulfate prevented invasion just as impressive as protamine itself. Since protamine sulfate is used in humans already in particular therapeutic situations, these results give hope for a possible clicinal benefit also in pharmacotherapy of listerial infections.