Investigation of the role of PKC-alpha for influenza A virus-induced signalling and of the inhibitory effect of Verapamil on virus replication

Abstract

Influenza Virus (IV) activates the Raf/MEK/ERK-(MAPK) cascade late in theirreplication cycle. This is essential for efficient nuclear RNP-export and therefore forproduction of infectious IV. To characterize cellular factors involved in MAPKactivationin the context of the viral infection I recently analyzed the role of PKC-alpha. Theresults so far indicate, that activation of the Ca2+ activated PKC-alpha is involved in the IVinduced MAPK-signaling and that specific inhibition of this function using a Ca2+channel blocker (Verapamil) at non toxic concentration, negatively affects IVpropagation (265). In addition, I have now further analyzed the action of Verapamil forpossible additional negative effects on IV replication. Therefore I have investigatedviral protein production in IV infected human lung epithelial cell line A549 and foundthat PB1, NP, and NS1 production is significantly reduced in IV infected andVerapamil treated A549 cells. Cell survival and cellular protein production does notseem to be affected ruling out a general effect of Verapamil on translation. Since PB1 isa functional important subunit of the viral polymerase the activity of the polymerasemight be affected. Therefore I analyzed the polymerase activity in Verapamil treatedcells for the production of viral mRNA using primer extension analysis of a reportertranscript expressed by either a plasmid based replication system or in virus infectedcells. My current results show that viral mRNA production in the plasmid based replicationsystem is not affected, while it seems to be reduced in virus infected cells. Thisindicates that Verapamil might alter viral transcription activity in virus infected cells.Taken together, PKC-alpha plays an important role in transmitting the influenza virusinduced signal to the MAPK-cascade. As this PKC-alpha inhibition can be achieved at nontoxicVerapamil concentration, leading to strong reduction of virus titers, inhibition ofthis cellular activity might be a potential anti-viral therapy. Influenzaviren (IV) aktivieren die Raf/MEK/ERK (MAPK)-Signaltransduktionskaskade in der späten Phase ihres Replikationszyklus. Dies istessentiell für einen effizienten RNP-Kernexport und damit für die Produktioninfektiöser Viren. Zur Charakterisierung zellulärer Faktoren, welche im Kontext derviralen Infektion die MAPK-Kaskade aktivieren, habe ich die Rolle von PKC-alphaanalysiert. Die bisherigen Ergebnisse zeigen, daß die Aktivierung der Ca2+-aktiviertenPKC-alpha an der virusinduzierten MAPK-Aktivität beteiligt ist, und das die Inhibitiondieser Funktion durch einen Ca2+-Kanalblocker (Verapamil) in nicht toxischenKonzentrationen die IV-Vermehrung negativ beeinflußt (265). Zusätzlich habe ichweitere negative Effekte der Wirkung von Verapamil auf die IV-Vermehrunguntersucht. Dafür habe ich die Produktion viraler Proteine in der IV-infiziertenhumanen Lungenalveolar-Epithelzellinie A549 analysiert. Dabei konnte ich zeigen, daßdie Expression von PB1, NP und NS1 in infizierten und Verapamil-behandelten A549-Zellen signifikant reduziert ist. Dabei führt die Verapamil-Behandlung nicht generell zueiner Beeinträchtigung des Zellüberlebens oder einer verringertenZellproteinproduktion. Da PB1 eine funktionell wichtige Untereinheit der viralen RNAabhängigenRNA-Polymerase (RDRP) ist, könnte die RDRP beeinflußt sein. Deshalbuntersuchte ich die Produktion viraler mRNA. Zum einen in transfizierten A549-Zellenin denen mittels eines plasmidgestützen Replikationssystem zur transienten Expressionviraler RDRP und eines vRNA-ähnlichen Pol1-Transkriopts virale mRNA gebildetwurde. Zum anderen wurde in transfizierten Zellen nur das vRNA-ähnliche Pol1-Trankript gebildet, welches dann durch die RDRP-Aktivität nach IV-Infektion dertransfizierten Zellen repliziert und transkribiert wurde. Die jetzigen Ergebnisse der Primer-Extension -Analyse zeigen, daß die Produktion viralen mRNA in demplasmidgestützten system nicht beeinflußt zu sein scheint, aber in den IV-infiziertenZellen. Das könnte bedeuten, daß Verapamil die virale Transkription in virusinfiziertenZellen beeinträchtigt. Zusammengefaßt kann man sagen, daß PKC-alpha eine wichtige Rollein der Signaltransmission der IV-induzierten MAPK-Kaskade spielt. Da Verapamil innicht toxischen Konzentrationen PKC-alpha inhibiert, die IV-Vermehrung hemmt undVerapamil als Pharmazeutika zugelassen ist, könnte Verapamil für einen anti-viralentherapeutischen Ansatz gegen IV nützlich sein.