Untersuchungen zur Kälteanpassung bei Listeria monocytogenes

Abstract

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung der Kälteschock-Antwort von L. monocytogenes. Mit Hilfe von Microarray-Analyse wurden die Transkriptionsprofile bei 37°C sowie jeweils nach einer, zwei und vier Stunden nach der Temperatursenkung auf 15°C ermittelt und verglichen. Die Analyse ergab, dass ca. 15 % des Genoms nach dem Kälteschock verändert exprimiert wurde. Die deutlichsten Unterschiede in den Expressionsprofilen fanden sich nach einer Stunde nach dem Kälteschock. Die beobachtete Anzahl an unterschiedlich exprimierten Regulatoren deutet auf die Anpassung mehrerer Stoffwechselwege hin. Kohlenstoffmetabolismus und Energieproduktion in Form von ATP, sowie Sekundärmetabolismus und Transportsysteme für Zucker und Aminosäuren verlangsamten sich. Die Expression von Virulenz- und Hitzeschock-relevanten Genen wurde runterreguliert. Damit werden Ressourcen für die Biosynthese der kälteinduzierten Proteine frei. Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass der am stärksten veränderte Prozess nach dem Kälteschock die Proteinbiosynthese ist. Es wurde kein spezieller Sigma-Faktor gefunden, der an der Expression der kälteinduzierten Gene beteiligt ist. Daher scheint die Anpassung der Proteinbiosynthese eher durch die Veränderungen am Ribosom zu erfolgen. Zum Beispiel ist bipA (lmo1067) ein möglicher Translationsfaktor, der speziell bei der niedrigen Temperatur verstärkt exprimiert wird und eine Rolle bei der Translation spielt. Die Bedeutung der RNA-Helikasen nach dem Kälteschock konnte noch einmal bestätigt werden. Die Gene der RNA-Helikasen wurden bei L. monocytogenes EGD-e deletiert und zeigten alle bis auf Delta lmo1246, einen kältesensitiven Phänotyp. Um die Kälteschockantwort bei L. monocytogenes genauer zu charakterisieren, wäre es interessant, die Target-Gene, auf deren Transkripten die RNA-Helikasen binden und die Translation nach dem Kälteschock begünstigen, zu identifizieren. Ihre Identifizierung könnte das Verständnis der nach Kälteschock veränderten Zellphysiologie vertiefen. Um die Regulation der Expression von RNA-Helikasen bei den niedrigen Temperaturen zu untersuchen, gilt es nun, diejenigen Faktoren zu finden, die an Promotor-Bereich der Helikase-Gene binden und so deren Expression regulieren. Auch die Interaktion zwischen den RNA-Helikasen und dem cspLA Gen ist noch nicht abschließend untersucht. Die Microarray-Analyse der Kälteschockantwort in der Delta cspLA Mutante im Vergleich zu dem Wildtyp könnte die Gene aufschließen, deren Transkription bei der Kälte durch cspLA beeinflusst wird. Die Expression des flaA Gens bedarf einer näheren Untersuchung. Bekannt ist, dass die Expression des flaA Gens in der Delta cspLA Mutante auf Transkriptionsebene verhindert wird (Busch, 1998). Ob ein Fehlen der entsprechenden Helikase die Synthese des FlaA-Proteins auf Transkriptions- oder Translationsebene hemmt, bedarf ebenfalls weiterer Experimente. Mit Hilfe einer flaA Sonde wäre ein Transkript des flaA Gens in den Delta-Helikasen-Mutanten nachzuweisen, bzw. auszuschließen. Die Frage nach einem globalen Sensor für die Kälte in L. monocytogenes blieb in vorliegender Arbeit offen. Zum Überprüfen dieser Hypothese bieten sich die Deletion des als potenzieller Sensor identifizierten Gens lmo0799 und eine anschließende Charakterisierung unter verschiedenen Temperaturen und Lichtbedingungen an. Low temperature stress is wide spread situation either for soil borne or pathogenic bacteria. Cold stress tolerance of L. monocytogenes markedly contributes to its dissemination through refrigerated food products. Ability to grow effectively at refrigerator temperatures leads to multiplication of bacteria to dangerous concentration even in slightly contaminated protein reach products and spoilage of the food. In this work are first presented the results of DNA micro-array based study about response of L. monocytogenes genome to the drop of temperature. Produced mutants contribute to under-standing of role of single genes in cold adaptation of L. monocytogenes. For analysis of transcriptional response of L. monocytogenes EGD-e to cold shock the sam-ples were taken after 1, 2, and 4 h after rapid decrease of grow temperature from 37°C to 15°C. Transcriptional profiles using whole-genome DNA micro-array after CS were com-pared to the one at 37°C. This approach revealed 214 induced and 220 genes with decreased expression after cold shock, which means 15 % of total genome. Maximal number of genes was observed after 1 h after cold shock, giving evidence for strong alteration of cell metabo-lism directly after cold shock. The large number of differently expressed regulator proteins indicates on the adaptation of many different metabolic pathways. Carbohydrate metabolism and energy production in form of ATP were repressed, as well as secondary metabolism and transport of sugars and amino acids. The expression of virulence and heat shock genes were also repressed. This could be the way to save the resources for expression of cold shock specific genes. The strongest effected process is protein biosynthesis. No special cold sigma factor for ex-pression of cold shock genes could be identified. So the adaptation of biosynthesis seems to go through the alteration of ribosomes. For example, the cold induced gene with GTPase ac-tivity bipA is a possible translation factor for adaptation of translation to the low temperature. The role of RNA-helicases on cold adaptation was affirmed. Deletion mutants were produced for all RNA helicases genes and showed beside of & #61508;lmo1246 the cold sensitive phenotype. For the better understanding of cold shock process it would be interesting to find the target genes, on which bind the RNA helicases and facilitate its expression at low temperature. The regulation of RNA helicases expression is itself a possible target for the further experiments. The question about the general cold sensor in L. monocytogenes remained open. For the vali-dation of this hypothesis deletion of the gene for potential sensor lmo0799 and characterisa-tion of mutant is possible.