Schistosoma mansoni: Tyrosinkinase-Signalwege in den Reproduktionsorganen und Aktin-Promotoranalysen im Transgenmodell

Abstract

Der humanpathogene Parasit Schistosoma mansoni zeigt ein im Tierreich nahezu einmaliges biologisches Phänomen - die vom Männchen beeinflusste Maturation des Weibchens. Während der Paarung werden Signalkaskaden im Weibchen initiiert, die Proliferations- und Differenzierungsprozesse in den Reproduktionsorganen steuern. Um die zugrunde liegenden molekularen Prozesse besser zu verstehen, wurden in unserer Arbeitsgruppe Gene kloniert und charakterisiert, die für Signalmoleküle kodieren. Darunter befand sich die zelluläre Syk-Kinase SmTK4, die Yeast Two-Hybrid (YTH)-Analysen zur Folge über ihre Tandem-SH2-Domäne an die Src-Kinase SmTK6, sowie schwächer auch an die Src-Kinase SmTK3 binden kann. Da darüber hinaus die Transkripte der drei Kinasegene im Ovar und den Testes co-lokalisieren, wurden Interaktionen ihrer Translationsprodukte in diesen Geweben angenommen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte die vermutete Interaktion von SmTK4 und SmTK6 über Co-Immunopräzipitationsexperimente bestätigt werden. Über YTH-Analysen wurde für SmTK6 ebenfalls eine Interaktion mit SmTK3 nachgewiesen. Daher wird postuliert, dass die drei cytoplasmatischen Tyrosinkinasen SmTK3, SmTK4 und SmTK6 in Form eines Kinasekomplexes vorliegen. Weiterhin wurde über YTH-Analysen ein neues, transmembranes Mucin identifiziert, dessen C-Terminus mit der SH2-Domäne der Src-Kinase SmTK6 interagiert. Als potentielle upstream - Interaktionspartner des postulierten Kinasekomplexes wurden der in dieser Arbeit entdeckte Integrinrezeptor Smbeta-Int1 sowie die bereits bekannte Rezeptortyrosinkinase SmRTK1 gefunden. Quantitativen YTH-Analysen zu Folge konnten die drei Tyrosinkinasen SmTK3, SmTK4 und SmTK6 über ihre Protein-Interaktionsdomänen in unterschiedlicher Stärke an die jeweiligen intrazellulären C-Termini dieser Rezeptoren binden, wobei SmTK3 die stärkste Bindung an Smbeta-Int1 und SmTK6 die stärkste Bindung an SmRTK1 aufwies. Aufgrund der identifizierten Interaktionen von Smbeta-Int1 und SmRTK1 mit SmTK4, SmTK3 bzw. SmTK6 und der Co-Lokalisation ihrer Gentranskripte im Ovar und den Testes adulter S. mansoni, ist in der vorliegenden Arbeit eine multifaktorielle Signalkaskade in diesen Geweben postuliert worden. Die Kooperation von Smbeta-Int1 mit SmRTK1 und/oder dem transmembranen Mucin führt zur Aktivierung von SmTK6, an deren Regulation vermutlich auch SmTK3 beteiligt ist. Durch die aktive SmTK6 wird SmTK4 rekrutiert und aktiviert, die ihrerseits bislang noch unbekannte Effektormoleküle phosphoryliert. Als ein potentieller downstream - Bindungspartner konnte bereits das Hitzeschockprotein-Homolog Smp40 identifiziert werden. Um Hinweise auf die funktionelle Bedeutung von SmTK4 zu erhalten, wurden Inhibitor- und RNAi-Experimente durchgeführt. Mit Hilfe einer whole mount - Färbetechnik in Verbindung mit konfokaler Mikroskopie gelang der Nachweis phänotypischer Veränderungen im Ovar und den Testes adulter Schistosomen, die entweder mit dem Syk-Kinase-spezifischen Inhibitor Piceatannol oder mit SmTK4-spezifischen dsRNA-Molekülen behandelt worden waren. Mit beiden Anätzen wurden übereinstimmende Effekte auf die Spermatogenese (Ausbleiben reifer, elongierter Spermien) und die Oogenese (erhöhte Anzahl maturer Oocyten) festgestellt. In parallel durchgeführten Experimenten zur Charakterisierung eines Promotors, der möglicherweise konstitutiv aktiv ist, wurden über 3 kb der 5 -Region des Kandidatengens Aktin (SmAct1) in silico identifiziert. Bis zu 1,5 kb große Varianten der 5 -Region wurden für die Konstruktion von GFP-Reportergenvektoren verwendet und in Particle Bombardment - Experimenten zur Erzeugung transient transgener Schistosomen eingesetzt. Konfokal-mikroskopische Untersuchungen sowie molekulare Analysen über RT-PCRs zeigten, dass ein 445 bp-Fragment der SmAct1-5 -Region für die Transkriptionsinitiation in Adulten und Larven von S. mansoni ausreicht. In der 5 -Region des SmAct1-Gens wurde eine für Promotoren von Aktin-Genen charakteristische Anordnung aus TATA-, CArG- und CAAT-Boxen identifiziert, welche zwischen Invertebraten und Vertebraten funktionell konserviert zu sein scheint. Das gewebespezifische Auftreten von GFP-Signalen in Tegument, Parenchym und Muskeln von Adulten sowie in verschiedenen, aber nicht allen Geweben von Sporocysten deutet darauf hin, dass es sich bei SmAct1 entgegen der vorausgehenden Annahme nicht um ein konstitutiv exprimiertes Gen handelt. The human parasite Schistosoma mansoni shows a nearly unique biological phenomenon - the male influenced maturation of the female. During paring, the male initiates signal transduction processes in the female, which govern proliferation and differentiation processes in the reproductive organs. To better understand the underlying molecular processes, several genes encoding signal transduction molecules were identified and characterized in our work group. Among these the Syk-family kinase SmTK4 was found, which interacts with the Src-kinase SmTK6 and also but weaker with the Src-kinase SmTK3, as indicated by yeast two-hybrid analyses. Since the transcripts of the three kinase genes co-localize in the ovary and testes, interactions of the translation products were assumed in these tissues. In this thesis, the postulated interaction of SmTK4 and SmTK6 could be confirmed by co-immunoprecipitation experiments. By yeast two-hybrid analyses, an interaction of SmTK6 with SmTK3 could be shown as well. Thus, it was postulated that these three cytoplasmatic tyrosine kinases SmTK3, SmTK4 and SmTK6 probably form a kinase complex. Furthermore, by the yeast two-hybrid analyses a new transmembrane mucin-like protein was identified, whose C-terminal part interacts with the SH2-domain of the Src-kinase SmTK6. Putative upstream interaction partners of the postulated kinase complex are the integrine receptor Smbeta-Int1, which was detected in this thesis, and the already known receptor tyrosine kinase SmRTK1. According to quantitative yeast two-hybrid analyses all three tyrosine kinases SmTK3, SmTK4 and SmTK6 were able to bind with different affinities to the respective intracellular parts of both receptors by their protein-interaction domains. SmTK3 revealed strongest binding to Smbeta-Int1 whereas SmTK6 was the strongest binding partner of SmRTK1. Due to the identified interactions of Smbeta-Int1 and SmRTK1 with SmTK3, SmTK4 or SmTK6, and on the basis of the co-localization of their gene transcripts in the ovary and the testes of adult S. mansoni, a multi factorial signaling cascade was postulated in these tissues. The interplay of Smbeta-Int1 with SmRTK1 and/or the transmembrane mucin leads to the activation of SmTK6, a process in which SmTK3 is probably also involved. Activated SmTK6 recruits and activates SmTK4, which phosphorylates so far unknown effector molecules. As one potential downstream binding partner, the heatshock-protein homologue Smp40 was identified. To elucidate the function of signaling pathways SmTK4 is involved in, inhibitor studies and RNAi experiments were performed. Using a whole-mount staining technique in combination with confocal microscopy, phenotypical changes were detected in the ovary and testes of adult schistosomes, which were treated with Piceatannol (Syk-kinase specific inhibitor) or dsRNA (SmTK4-specific). With both approaches corresponding effects on spermatogenesis (absence of mature, elongated sperms) and oogenesis (increased number of mature oocytes) were discovered. In parallel experiments aiming to characterize a promoter, which may be constitutively active, about 3 kb of the 5 region of the candidate gene actin (SmAct1) were identified in silico. Fragments up to 1.5 kb of this 5 region were used for GFP-reporter gene constructing and employed in particle bombardment experiments to generate transiently transgenic schistosomes. A 445 bp fragment was found to be sufficient for transcription initiation in adults or larvae from S. mansoni as confirmed by confocal microscopy and RT PCR experiments. An actin-gene characteristic assembly of TATA, CArG, and CAAT boxes was identified, which seems to be functionally conserved between vertebrates and invertebrates. The tissue-specific appearance of GFP signals in the tegument, parenchyma and muscles of adults as well as in several, but not all tissues of sporocysts, indicated that contrary to first assumptions the SmAct1 gene is not constitutively expressed.