Entwicklung eines ELISA zur Diagnose von viszeraler Leishmaniose

Abstract

Leishmaniosen sind in 88 Ländern der Welt -vor allem in Entwicklungsländern- verbreitet und fordern jährlich bis zu 59.000 Tote. Diese Krankheiten werden von Parasiten der Gattung Leishmania hervorgerufen, die durch Sandmücken der Gattungen Phlebotomus und Lytzomyia übertragen werden. Leishmaniosen zeigen in Abhängigkeit vom Immunstatus des Wirtes und der sie auslösenden Spezies sehr unterschiedliche klinische Manifestationen. Die gefährlichste dieser Krankheiten ist die viszerale Leishmaniose, die unbehandelt in über 90% der Fälle zum Tode führt.Eine ähnliche Symptomatik wie bei kutaner Leishmaniose und verschiedenen anderen Erkrankungen erschwert die Diagnose dieser Krankheit. Darüber hinaus haben die verfügbaren Medikamente gegen viszerale Leishmaniose stark toxische Nebenwirkungen.Verfügbare diagnostische Tests sind unzureichend und meist teuer. Die erschwinglichen Tests sind nicht sensitiv genug, um eine sichere Diagnose zu erstellen, da meistens Rohextrakte promastigoter Leishmanien benutzt werden, die Kreuzreaktionen mit kutaner Leishmnaiose zeigen. Der beste Test ist ein ELISA auf der Grundlage des rekombinanten Antigens K39, der jedoch Mängel in der Reproduzierbarkeit in verschiedenen Endemiegebieten aufweist. Um eine Verbesserung der bisher verfügbaren ELISA-Tests zu erreichen, wurden Antigene gesucht, die sich tandemartig wiederholende Aminosäuresequenzen aufweisen, welche auf eine gute Immunreaktivität hinweisen.Mit Hilfe im Internet verfügbarer Datenbanken und Programme wurden potentielle Antigene zur Diagnose von viszeraler Leishmaniose ausfindig gemacht, kloniert, mit dem rekombinanten Antigen K39 fusioniert und im ELISA getestet. Das daraus entstandene Antigen AK2708 besteht aus einer Fusion von vier verschiedenen Antigenen, ist kostengünstig herzustellen und unterscheidet im ELISA kutane und viszerale Leishmanioseseren aus verschiedenen Endemiegebieten besser als ein Rohextrakt aus promastigoten Leishmanien. Leishmaniases are considered to be endemic in 88 countries, most of them developing countries, causing 59.000 deaths per year. These diseases are caused by parasitic protozoa of the genus Leishmania. Humans are infected via the bite of phlebotomine and lytzomyia sandflies. Depending on the causative agent and the immune status of the host the disease shows different clinical manifestations. Visceral Leishmaniasis is the most dangerous form, which is fatal if untreated in over 90% of all cases.The symptoms at the beginning of visceral leishmaniasis show similarities to those of cutaneous leishmaniasis and other diseases. All currently available drugs have serious drawbacks. Simple diagnostic tests have recently been developed which are practical and inexpensive but lack sensitivity because they use crude extract of promastigote Leishmania. Better tests based on recombinant antigens are very expensive. Only the rekombinant K39 antigen shows a good performance in ELISA in general, which is unfortunately not reproducable in different foci of visceral leishmaniasis.To improve existing diagnostic ELISA-tests, new antigens were searched with tandem repeated amino acid sequences which are supposed to be immundominant.Some antigens were found by the help of gene-databases and computerprogramms freely available in the internet. These were cloned and fused with K39 resulting in a protein which consist of four fused different antigens (AK2708). This antigen performs well in ELISA with visceral leishmaniasis sera and distinguishes better between cutaneous and visceral leishmaniasis from different endemic regions than a crude extract from promastigote Leishmania.