Untersuchung immunbiologischer Effekte von Sanglifehrin A bei dendritischen Zellen in vitro und in vivo

Abstract

Sanglifehrin A (SFA) ist ein Immunsuppressivum. Es gehört zur Klasse der Makroliden und wird vom Aktinomyceten Stamm Streptomyces A92-308110 produziert. SFA bindet an Cyclophilin A, dem Bindungsprotein von Cyclosporin A (CsA). Obwohl SFA eine höhere Affinität zu Cyclophilin A besitzt als CsA, inhibiert SFA nicht die Aktivität der Calcineurin-Phosphatase, sondern inhibiert die Phosphorylierung der RAF-1 Kinase (Sanchez-Tillo, Wojciechowska et al. 2006). Verschiedene Arbeitsgruppen haben darüber berichtet, dass SFA einzigartige immunsuppressive Effekte bei humanen und murinen Dendritischen Zellen (DCs) zeigt (Steinschulte, Taner et al. 2003; Ko, Hambly et al. 2008). Die Wirkungsweise von SFA ist dennoch nicht vollständig geklärt.Die vorliegende Dissertation präsentiert neue Daten zur immunregulierenden Funktion von SFA bei DCs. Aus der cDNA-Microarray-Analyse konnte geschlossen werden, dass SFA die konstituive Expression von 190 Genen herunter und die von 70 Genen hoch regulierte. Die in silico-Analyse legt nahe, dass SFA in vielen immunologisch relevanten Signalwegen involviert ist, so zum Beispiel in Zytokin-Zytokinrezeptor-Interaktion und zahlreiche Chemokine inhibiert, darunter CCL5, CCL17, CCL19, CXCL9 und CXCL10 auf mRNA-Ebene. Die Chemokinsuppression nach SFA-Behandlung konnte auf Proteinebene dosisabhängig gezeigt werden. Für CCL19 konnte eine Suppression nach vorangegangener LPS oder Poly I:C/IFNgamma Stimulation festgestellt werden, diese Liganden interagieren mit zwei verschiedenen TLRs. Gegenüber anderen Immunsuppressiva zeigte allein SFA eine pleiotrope Chemokinsuppression, kein anderes hier untersuchtes Immunsuppressiva (Cyclosporin A, Rapamycin oder Dexamethason) zeigte eine vergleichbare breite Wirkung auf die Chemokinexpression. Die kombinierte Gabe von SFA und CsA sorgte für eine verstärkte Chemokinsuppression im Vergleich zu der alleinigen Gabe eines der beiden Immunsuppressiva. Die CCR7-Oberflächenexpression der DCs blieb durch SFA unbeeinflusst. Chemotaxis-Assays zeigten eine verminderte Migration von aktivierten SFA-behandelten humanen DCs zu dem Chemokingradienten CCL19, dies ist auf eine Inhibition der CD38-Expression zurückzuführen. CD38 ist ein Ektoenzym, von dem berichtet wird, dass es die DC-Migration und die Zytokin-Produktion reguliert. Auch CD38 wurde auf Genebene und dosisabhängig auf Proteinebene durch SFA supprimiert. Vice versa war die Migration von unbehandelten aktivierten DCs und T-Zellen zu den Überständen SFA-behandelter DCs inhibiert, dies ist u.a. auf eine verminderte Menge an Chemokinen in den Überständen zurückzuführen. SFA-behandelte T-Zellen zeigten auch eine erniedrigte Migration zu den Chemoattraktanten CCL19, CCL5 und CCL17 im Vergleich zu Trägersubstanz-behandelten T-Zellen. In vivo konnte eine verminderte Migration von FITC+/CD11c+-Zellen zum Inguinal-Lymphknoten, von zuvor SFA-behandelten C57BL/6NCrl-Mäusen im Vergleich zu Trägersubstanz-injizierten Mäusen, festgestellt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese erste systematische genomweite Studie eine neue anti-inflammatorische Wirkweise von SFA zeigt, die sich von CsA unterscheidet. Die Ergebnisse dieser Arbeit identifizieren SFA als einen neuen Chemokin- und Migrationsinhibitor Dendritischer Zellen. Die Migration Dendritischer Zellen in Geweben und sekundäre Lymphorgane spielen eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der Immunantwort. Sanglifehrin A (SFA) is an immunosuppressive drug. It is a representative of a class of macrolides produced by the actinomycetes strain Streptomyces A92-308110 that bind to cyclophilin A (CypA), the binding protein of Cyclosporine A (CsA). Although SFA has a higher affinity than CsA for cyclophilin, SFA does not inhibit the activity of calcineurin phosphatases, but SFA inhibits RAF-1 kinase phosphorylation (Sanchez-Tillo, Wojciechowska et al. 2006). Different groups have reported that SFA exerts unique suppressive effects on human and mouse dendritic cells (DC) (Steinschulte, Taner et al. 2003; Ko, Hambly et al. 2008). The mechanism of action of SFA is still unknown. This study presents new data about the immunoregulatory function of SFA in DCs. SFA blocked the expression of 190 gene and upregulated 70 genes which was shown by cDNA-microarray. In silico analysis groups regulated genes into immunological signalling pathways, for example cytokine cytokine-receptor interaction. Several chemokines are regulated at the mRNA-level, e.g. CCL5, CCL17, CCL19, CXCL9 and CXCL10. These chemokines are dose dependently regulated by SFA. The expression of CCL19 was reduced after LPS or Poly I:gamma stimulation. The ligands interact with two different TLRs. SFA is a pleiotropic chemokine suppressor in comparison to cyclosporin A, rapamycin or dexamethasone. The other immunosuppressive drugs could not suppress all chemokines like SFA. The combined exposure of SFA and CsA resulted in a strengthen chemokine suppression compared to immunosuppressive drugs allone.CCR7 surface expression on DCs is not influenced by SFA. Chemotaxis assays demonstrated impaired migratory activity of maturing, SFA-exposed DCs against CCL19. This impaired migration is caused by a CD38 suppression. CD38 is an ectoenzyme that was reported to regulate DC migration and cytokine production. CD38 is downregulated at the gene and dose dependent at the protein level after SFA treatment. Vice versa, supernatant of SFA-exposed DCs exhibited impaired activity to promote DC and CD4 T cell migration. The suppressed migration is caused among other things by inhibited chemokine expressions. SFA treated T cells do not migrate as good as vehicle treated T cells towards the chemoattractants CCL5, CCL17 and CCL19. In vivo, the shortterm treatment of C57BL/6NCrl mice with SFA resulted in a reduced migration of FITC+/CD11c+ double positive cells to the inguinal lymph node.In conclusion, this first systematic genome-wide study revealed a novel anti-inflammatory mode of action of SFA being different from the related agent CsA. The results of this thesis identify SFA as a novel DC chemokine and migration inhibitor. Migration of DCs into tissues and secondary lymphoid organs plays a crucial role in initiating the immune response.