Funktionelle und strukturelle Untersuchungen zur ternären Komplexbildung zwischen MutS und MutL im mismatch-Reparatursystem

Abstract

Ein wichtiger Schritt im mismatch Reparatur System (MMR) ist die Ausbildung des ternären Komplexes aus MutS, MutL und DNA nach der Erkennung der Fehlpaarung durch MutS. Dieser transiente Komplex soll in der Folge weitere Reparaturproteine aktivieren bzw. koordinieren. Zwar sind Kristallstrukturen für die einzelnen E. coli MMR Proteine MutS und MutL seit über 10 Jahren bekannt, nicht jedoch die Struktur des Komplexes. Eines der Hauptprobleme ist dabei die Dynamik des Komplexes. In der hier vorliegenden Arbeit wurden strukturelle und funktionelle Informationen zur ternären Komplexbildung der E. coli MMR Proteine MutS und MutL mit DNA erarbeitet und ein Strukturmodell erstellt. Die Methoden der Wahl waren dabei chemisches Modifizieren mit Fluoreszenzfarbstoffen und cysteinspezifisches Quervernetzen (crosslinking) von endogen vorhandenen oder durch zielgerichtete Mutagenese in MutS und MutL eingeführten Cysteinresten. Auf diese Weise wurden Positionen in den Proteinen bestimmt, die in der Nähe der Proteininteraktionsstellen von MutS bzw. MutL liegen. Ferner konnte der Komplex durch das chemische Quervenetzen stabilisiert werden, so dass der Komplex derzeit in hochauflösenden strukturellen Methoden, wie Kristallisation oder Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS) analysiert werden kann.MutS besteht aus sieben Domänen. Es wurden Einzelcysteinvarianten mit einem Cysteinrest in jeweils einer dieser Domänen mit Ausnahme der C terminalen Dimerisierungsdomäne über zielgerichtete Mutagenese hergestellt. Mit Hilfe der Crosslinkexperimenten konnte zeigt werden, dass Positionen in der ATPase Domäne im N terminalen Fragment von MutL (Aminosäurereste 1 200), insbesondere die Positionen 131 und 135 in räumlicher Nähe zu den Positionen 8, 78 und 93 in der mismatch Bindungsdomäne (MBD, Aminosäurereste 1 115) von MutS liegen. Diese Crosslinkreaktionen sind offenbar hoch spezifisch, denn die Crosslinks zwischen MutS und MutL bilden sich nur unter Bedingungen aus, die für die ternäre Komplexbildung notwendig sind, d. h. in Anwesenheit von ATP und mismatch DNA.Ein weiterer kovalenter Komplex von MutS und MutL konnte erzeugt werden, wenn MutS Varianten eingesetzt wurden, in denen ein Cysteinrest entweder in der für die an der Interaktion beteiligten connector Domäne (116 266)2 oder in der strukturell angrenzenden core/levers Domäne (267 443 und 504 567) vorhanden ist. Interessanterweise war diese Crosslinkreaktion zwar DNA abhängig, konnte aber auch mit ADP anstelle von ATP beobachtet werden. Dieses Ergebnis war für die Erstellung eines Strukturmodells des MutS MutL Komplexes hilfreich, da im Gegensatz zur mismatch Bindungsdomäne die connector Domäne sowohl in Ab als auch in Anwesenheit von DNA und unabhängig von der Nukleotidbindung strukturell unverändert vorliegt. Ein weiteres wichtiges Ergebnis der vorliegenden Arbeit ist die mismatch und ATP induzierte interne Crosslinkreaktion von MutS zwischen Cys 93 in der mismatch Bindungsdomäne und Cys 239 in der connector Domäne. Dieses Resultat ist der erste direkte experimentelle Hinweis auf eine seit langem postulierte ATP induzierte Konformationsumwandlung der mismatch Bindungsdomäne weg von der DNA und hin zur connector Domäne.Die Crosslinkergebnisse konnten durch chemisches Modifizieren der Proteine und anschließende Funktionsanalysen von MutS und MutL, z. B. in der MutS/MutL abhängigen Aktivierung der Endonuklease MutH sowie durch analytische Ultrazentrifugationsstudien mit Fluoreszenzdetektion (in Zusammenarbeit mit Dr. Ute Curth, Hannover) bestätigt werden. Zum Schluss war es möglich, auf der Basis der vorhandenen Ergebnisse die mögliche Interaktionsstelle zwischen MutS und MutL präziser als bisher festzulegen. Allerdings ist es bislang nicht gelungen, über Protein Protein Docking, in silico ein Modell für die Interaktion zwischen MutS und MutL zu erstellen, da die Orientierung von MutL nicht ausreichend eingegrenzt werden konnte. Die vorhandenen Daten sind aber ein vielversprechender Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen. The ternary MutS MutL DNA complex is a key intermediate in the mismatch repair (MMR) system for which up to date little structural information is available. Though several research groups have tried to solve this issue employing different biochemical, biophysical and bioinformatics approaches, the structure of the ternary complex still remains elusive. One of the major problems hampering the structural analyses is the highly dynamic nature of this complex. Therefore the aim of the present thesis was the identification of transient MutS-MutL interaction sites in the MMR system, in order to characterize the ternary complex functionally, to generate a structural model of the complex and to trap the complex chemically for high resolution structural studies.As a method of choice, chemical modifications with fluorescent dyes and crosslinking of single cysteine variants of MutS and MutL were used in order to (i) identify positions that are in close proximity within the complex and (ii) to trap the complex for further structural studies. To this end, single cysteine MutL variants with cysteine residues in all three domains were generated. Furthermore, single cysteine MutS variants were generated with a cysteine residue located in one of its seven domains (except for the C-terminal dimerization domain). Using these variants, I could demonstrate that position 131 in the N-terminal domain of MutL can be crosslinked to positions 8, 78 or 93 in the mismatch binding domain (domain I) of MutS. This crosslinking reaction was highly specific as it only occurred under conditions known to induce ternary complex formation, i. e. in the presence of a mismatched DNA as well as of ATP that had been proposed previously to induce a conformational change in MutS (Iyer, Modrich, 2006)1. In addition, two other crosslinked complexes were obtained using MutS variants containing a single cysteine in the connector domain (domain II) and in the lower part of the core/levers domain (domain III), which is in close proximity to the connector domain. These complexes are DNA and nucleotide dependent but independent of ATP. Residue 246 in the connector domain forms the crosslink with the highest yield which is also observed when using a short crosslinker. Finally, an important mismatch and- ATP induced conformational change could be monitored via the formation of an internal crosslink between the mismatch binding domain, at Cys 93, and the connector domain, at Cys 239 of MutS. The observed crosslink suggests a movement of the mismatch binding domain towards the connector domain. The results presented in this thesis are in full agreement with a work published very recently (Mendillo, Kolodner; Nov. 2009)2 showing that MutL binds to the connector domain of MutS.Results from the crosslinking experiments were supported by chemical modification and functional analyses via MutS dependent MutH activation and analytical ultracentrifugation with fluorescence detection (in cooperation with Dr. Ute Curth, Hannover). Furthermore, anisotropy and Förster resonance energy transfer (FRET) assays were established to monitor MutS DNA and MutS MutL complex formation. In summary, we have for the first time obtained structural information for two key events in DNA mismatch repair, i. e. the mismatch- and ATP induced conformational change in MutS and the interaction between MutS and MutL on DNA. For both events, covalently trapped complexes are available that will allow further studies and, last but not least, can result in crystals for high resolution structural studies such as SAXS, AFM, Cryo-EM or X ray crystallography.