Molekulare Mechanismen der Wirkung der leberspezifischen microRNA-122 auf die Translation der Hepatitis C Virus-RNA

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde der molekulare Mechanismus der Stimulation der Translation der Hepatitis C Virus-RNA durch die leberspezifische microRNA-122 in humanen Zelllinien sowie in dem in vitro Translationssystem Kaninchen-Retikulozyten-Lysat (RRL) untersucht.Das Hepatitis C Virus (HCV) ist ein Positivstrang-RNA-Virus der Familie Flaviviridae, das bevorzugt in humanen Leberzellen repliziert. Ein früher Schritt im Vermehrungszyklus des HCV ist die Translation des viralen RNA-Genoms. Die Initiation der Translation der HCV-RNA erfolgt unabhängig von einem Cap-Nukleotid an einer internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) in der 5´-nicht-translatierten Region (5´-NTR) des Virus-Genoms. microRNAs sind einzelsträngige nicht-kodierende RNAs mit einer Länge von etwa 22 Nukleotiden, die gewebespezifisch exprimiert werden. Als Bestandteil von microRNA-Protein-Komplexen (miRNP-Komplexen) fungieren sie hauptsächlich als Regulatoren der posttranskriptionellen Genexpression. Die Regulation der Translation erfolgt im Allgemeinen durch Interaktion der microRNA mit Ziel-Sequenzen in der 3´-NTR der mRNA, was zu einer Repression der Protein-Synthese führt. Dagegen stimuliert die leberspezifische microRNA-122 (miR-122) die IRES-vermittelte Translation einer HCV-Reporter-RNA in humanen Zelllinien.In dieser Arbeit wurde die biologische Relevanz der Stimulation der HCV-Translation durch miR-122 durch Studien mit vollständiger genomischer HCV-RNA in humanen Hepatoma-Zellen bestätigt. Weiterhin wurde gezeigt, dass die HCV-Translation auch im nicht-hepatozellulären in vitro Translationssystem RRL durch Zugabe von reifer miR-122 gefördert wird. Die Stimulation der HCV-Translation wird in RRL wie in humanen Zellen durch Interaktion der miR-122 mit Ziel-Sequenzen in der 5´-NTR der viralen RNA vermittelt. Weitere Analysen ergaben, dass die Stimulation der HCV-Translation durch miR-122 in vitro und in lebenden Zellen auf unterschiedlichen Wirkmechanismen beruht. Die Translationsstimulation in RRL erfolgt im Stadium der Initiation. Eine verstärkte Basenpaarung einzelsträngiger miR-122 mit der HCV-5´-NTR führt zur Blockierung einer inhibitorischen RNA-RNA-Interaktion zwischen Sequenzabschnitten der Protein-kodierenden Region und der 5´-NTR der HCV-RNA, was die Effizienz der Translation steigert. miR-122-assoziierte Proteine spielen dabei in RRL eine untergeordnete Rolle, da auch die Hybridisierung anderer einzelsträngiger RNA-Oligonukleotide verschiedener Länge mit der HCV-5´-NTR die Translation fördert. Die Stimulation der HCV-Translation in lebenden Zellen erfolgt dagegen unabhängig von der Ausbildung der inhibitorischen RNA-RNA-Interaktion und erfordert die Transfektion von doppelsträngigen Vorläufern der miR-122 mit exakter Länge, während einzelsträngige microRNAs keine translationsfördernde Wirkung haben. Die Resultate der vorliegenden Arbeit weisen auf eine Beteiligung von miR-122-assoziierten Proteinen in miRNP-Komplexen bei der Stimulation der HCV-Translation in lebenden Zellen hin und zeigen, dass die weitere Untersuchung des Einflusses der miR-122 auf die HCV-Translation in intakten Zellen erfolgen sollte. In the present study, the molecular mechanism of the stimulatory effect of the liver-specific microRNA-122 on translation of the hepatitis C virus RNA was investigated in human cell lines and in the in vitro translation system rabbit reticulocyte lysate (RRL).The hepatitis C virus (HCV) is a positive strand RNA virus classified into the family Flaviviridae. HCV preferentially propagates in human hepatocytes. An early step in the viral replication cycle is the translation of the viral RNA genome. Translation initiation is mediated independently of a cap-nucleotide by an internal ribosome entry site (IRES) located in the 5´-nontranslated region (5´-NTR) of the HCV-RNA. microRNAs are tissue-specific small non-coding RNAs of about 22 nucleotides. Within microRNA-protein complexes (miRNP complexes) they mainly act as regulators of posttranscriptional gene expression. Regulation of translation is mediated by the interaction of microRNAs with target sequences in the 3´-NTR of cellular mRNAs, usually leading to repression of protein synthesis. In contrast, the liver-specific microRNA-122 (miR-122) stimulates IRES mediated translation of an HCV-reporter-RNA in human cell lines.In this study the biological relevance of the stimulatory effect of miR-122 on HCV translation could be confirmed by investigating the translation of complete genomic HCV RNAs in human hepatoma cells. It is further shown that translation stimulation also takes place in the non-hepatocellular in vitro translation system RRL when miR-122 is added. In RRL as well as in human cells HCV translation stimulation is mediated through interaction of miR-122 with target sequences in the 5´-NTR of the viral RNA. However, further analysis showed that the stimulation of HCV translation by miR-122 in RRL is based on a different molecular mechanism compared to living cells. In RRL translation stimulation takes place early in the initiation phase. Extended base pairing of single stranded miR-122 with the HCV 5´-NTR blocks the formation of an inhibitory RNA-RNA interaction between protein-coding sequences and the 5´-NTR of the HCV RNA and therefore stimulates translation efficiency. In this process, in RRL, miR-122-associated proteins play a minor role since also hybridization with the HCV 5´-NTR of other single stranded RNA-oligonucleotides of different length stimulate translation. In contrast, in living cells stimulation of HCV-translation occurs independently of the formation of the inhibitory RNA-RNA interaction. Moreover, the stimulatory effect can only be detected upon transfection of double stranded miR-122 precursors of exact length, whereas transfection of single stranded microRNAs does not elevate translation efficiency of the HCV RNA. These results indicate that miR-122-associated proteins in miRNP complexes contribute to HCV translation stimulation in living cells and suggest, that intact human cells should be used to further analyse the effect of miR-122 on HCV-translation.