Development of affordable molecular techniques for the diagnosis of leishmaniasis in Yemen

Abstract

Leishmaniasis is an infectious disease caused by different species of unicellular Leishmania parasites which are transmitted by the bite of sandflies. As first clinical symptome, a non-healing ulcerous wound of up to several centimeters diameter forms around the byte of the insect. After several months, the wound may heal spontaneously leaving a scar. If the infection was due to a less virulent species of the parasite, the patient is healed and resistant against this form for the rest of life. However, other strains of the parasite lead to mucocutaneous leishmaniasis which lead to painfull destructions of the mucosa of lipps and nose, or to visceral leishmaniasis which affects inner organs and is lethal without treatment. Cutaneous as well as visceral leishmaniasis are endemic in the Republic of Yemen, but due to limiting financial resources, the disease is neither appropriatelytly diagnosed nor treated in the population. Recorded epidemiological data exist only for some governmental hospitals, but the number of unregisterd cases may be huge. In order to shed more light in the real extent of the disease in Yemen and to contribute to future control measures, it was attempted to design new molecular procedures for the diagnosis, which are, at the one hand, highly sensitive and specific, at the other hand not too complicated and inexpensive, so that they could be performed under the limiting conditions of the country. To obtain some insight in the sitation of leishmaniasis, the data registered in governmental hospitals during the past years were collected and evaluated. In addition, samples from more than 200 patients with suspected cutaneous and visceral leishmaniasis were collected in different parts of the country. These samples were analysed first in Yemen by microscopy for cutaneous leishmaniasis and by a highly unspecific procedure called formol gel precipitation for visceral leishmaniasis Some of the samples were also analysed by a commercial ELISA. From all collected blood samples the plasma fraction and DNA from enriched leucocytes were prepared and transported to the University of Giessen for further analysis. By using the available sequence data of the Leishmania strains L. infantum (visceral leishmaniasis) and L. major (cutaneous leishmaniasis), specific PCR primers were developed for the design of new diagnostic procedures. The assays were tested by means of purifed DNA from these two strains which had been cultivated in the laboratory. Five different target sites from highly repeated sequences of the genomes were selected to develop new diagnostic PCR assays. Two assays specific for the genus Leishmania, and one assay allowing differentiation of the two strains were constucted allowing to discriminate between cutaneous and visceral leishmaniasis. Applying these tests on the patient samples collected in Yemen revealed that PCR diagnosis is more sensitive and specific than the traditional methods used. Of course, neither a comprehensive epidemiology of Yemen nor a ultimative perfect diagnostic protocol could be obtained during this work. This has to be established during the following years. However, the results reveal at the one hand that the situation of leishmaniasis in Yemen is more severe than officially stated. At the other hand, diagnostic procedures were developed which are simple and inexpensive enough to be introduced in the country. When optimized, these techniques may lead to more awareness of this disease in the country and to an improvement of the health condition of the suffering population. Die Leishmaniose ist eine durch einzellige Parasiten der Gattung Leishmania verursachte Infektionskrankheit, die durch den Stich von Sandmücken übertragen wird. Als erstes klinisches Symptom bildet sich eine nicht abheilende ulceröse Wunde von bis zu mehreren cm Durchmesser um die Einstichstelle herum. Nach mehreren Monaten kann die Wunde unter Hinterlassung einer Narbe spontan abheilen. Falls es sich um eine Infektion mit einer weniger virulenten Form des Parasiten gehandelt hat, ist der Patient geheilt und für den Rest des Lebens resistent gegen diese Form. Andere Stämme des Parasiten lösen aber die mucocutane Form der Krankheit aus, die zu schmerzhaften destruktiven Läsionen der Lippen- und Nasenschleimhäute führt, oder die viszerale Form der Leishmaniose, die innere Organe angreift und unbehandelt tödlich verläuft. In der Republik Jemen sind die cutane und die viszerale Leishmaniose endemisch, werden aber aus Mangel an Geld in der Bevölkerung weder hinreichend diagnostiziert noch behandelt.Aufzeichnungen über epidemiologische Daten gibt es nur für wenige staatliche Krankenhäuser, die Zahl der unregistrierten Fälle ist wahrscheinlich sehr hoch. Um in Zukunft zu Kontrollmaßnahmen gegen die Krankheit beitragen zu können, wurde der Versuch unternommen, neue molekulare Diagnoseverfahren zu entwickeln, die einerseits sehr empfindlich und spezifisch sind, andererseits aber nicht zu kompliziert und teuer, so dass sie unter den limitierten Voraussetzungen des Landes realisiert werden können.Um eine Einblick in das wahre Ausmaß der Krankheit im Jemen zu erhalten, wurden die in den staatlichen Krankenhäusern in den letzten Jahren gesammelten Daten ausgewertet. Außerdem wurden in verschiedenen Teilen des Landes mehr als 200 Proben von Patienten mit dem Verdacht auf cutane oder viscerale Leishmaniose gesammelt. Dies Proben wurden zunächst im Jemen mikroskopisch auf cutane Leishmaniose und mit Hilfe einer sehr unspezifischen Formol-Präzipitation-Methode auf viscerale Leishmaniose untersucht. Für einige Proben stand ein kommerzieller ELISA zur Verfügung. Von allen gesammelten Blutproben wurde die Plasmafraktion und aus angereicherten Leukozyten die DNA gewonnen und für nähere Analysen zur Universität Giessen gebracht.Von den mittlerweile verfügbaren Sequenzdaten für die Leischmania-Stämme L. infantum (viszerale Leishmaniose) und L. major (cutane Leishmaniose) wurden spezifische PCR-Primer für die Entwicklung neuer Diagnoseverfahren abgeleitet. Die neuen Verfahren wurden anhand von gereinigter DNA dieser beiden im Labor kultivierten Stämme getestet. Zur Entwicklung neuer PCR-Verfahren wurden fünf verschiedene Zielsequenzen von hoch-repetitiven Regionen der Genome ausgewählt. Zwei Genus-spezifische Tests und ein Test, der die Unterscheidung von cutaner und viszeraler Leishmaniose zulässt, wurden erfolgreich entwickelt.Die Anwendung dieser Tests für die im Jemen gesammelten Patientenproben ergab, dass die PCR-Diagnose wesentlich empfindlicher und spezifischer ist, als die traditionell eingesetzten Methoden. Freilich konnte im Rahmen dieser Arbeit weder ein vollständiges Bild über die Epidemiologie der Leishmaniose im Jemen noch ein endgültig perfektes Diagnoseprotokoll entwickelt werden. Dies wird Aufgabe für die folgenden Jahre sein. Immerhin weisen die ermittelten Daten einerseits darauf hin, dass die Lage der Leishmaniose im Jemen sehr viel schwerwiegender ist, als offiziell zugegeben. Andererseits wurden diagnostische Verfahren entwickelt, die ausreichend einfach und so kostengünstig sind, dass sie im Land selbst eingeführt werden können. In optimierter Form könnten diese Verfahren zu einem besseren Stand der Kenntnis über diese Krankheit im Land führen und auf Dauer zu einer Verbesserung der gesundheitlichen Situation der Bevölkerung beitragen.