Mechanismus der Inhibition und Aktivierung der Caspase-aktivierten DNase

Abstract

Der DNA Fragmentierungsfaktor DFF ist ein apoptotischer Protein Komplex, der aus den Untereinheiten CAD (Caspase aktivierte DNase) und ICAD (Inhibitor der Caspase aktivierten DNase) besteht. Da bis dato noch keine komplette Kristallstruktur des DFF Komplexes zur Verfügung steht, ist größtenteils immer noch unklar wie die beiden Untereinheiten, CAD und ICAD, auf molekularer Ebene miteinander interagieren. Der genaue Mechanismus der CAD Inhibition durch ICAD ist daher ebenso ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurde die SPOT (peptid array) Methode verwendet, um Protein Protein Wechselwirkungen von CAD und ICAD zu identifizieren. Seitens CAD wurde eine besonders starke Interaktion der C2 Domäne mit ICAD detektiert. Diese Domäne vermittelt die Dimerisierung zweier CAD Monomere und ist essentiell für die Aktivierung von CAD. Dieses Ergebnis ist der erste experimentelle Nachweis für eine direkte Interaktion von ICAD mit der Dimerisierung (D2) Domäne von CAD. Es lässt sich mit hoher Wahrscheinlichkeit vermuten, dass ICAD die Aktivität von CAD reguliert, indem es durch Binden dieser Domäne die Ausbildung der aktiven, homodimeren Scherenstruktur von CAD unterdrückt. Weitere Ergebnisse dieser Arbeit zeigen wichtige Kontakte zwischen ICAD und der Zn2+ Bindestelle sowie dem aktiven Zentrum von CAD. Diese legen einen zweistufigen Mechanismus der CAD Inhibition durch ICAD nahe, in dem die apoptotische Nuklease CAD zum einen durch das Unterdrücken der Homodimerisierung und zum anderen, auf Ebene des CAD Monomers, durch eine strukturelle Veränderungen oder das direkte Blockieren des aktiven Zentrums inhibiert wird. Das Prinzip des dualen Mechanismus der CAD Inhibition wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ebenso seitens ICAD bestätigt. Hier konnten durch biochemische Untersuchungen und Mutationsstudien zwei ICAD Bereiche identifiziert werden, die sehr wahrscheinlich am Mechanismus der Inhibition von CAD durch ICAD beteiligt sind. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass dieser Bereich keine Rolle bei der Interaktion zweier ICAD Moleküle spielt, sondern vielmehr exklusiv an der Wechselwirkung mit CAD beteiligt ist.