Ultrastrukturelle Lokalisation des Glykoproteins Ependymin im Mittelhirndach(Tectum opticum) von Goldfischen und der Einfluss von Dressurversuchen

Abstract

Ependymine wurden erstmalig 1976 nach Verhaltensexperimenten in der Ependymalen Zone in Goldfischen entdeckt. Die Ependymale Zone besteht vorwiegend aus Gliazellen und kleidet die Ventrikel des Gehirns aus. Die Familie der Ependymine umfasst neben sekretorischen Glykoproteinen im Gehirn verschiedener Knochenfische auch Verwandte in Seegurken und Gene in zahlreichen Tierarten bis hinab zum Einzeller, andererseits aber auch die Mammalian Ependymin Related Proteins (MERPs) der Säugetiere. Die Ependymine der Goldfische (Genbank Accession-No.: gf-I X14134 und U00433; gf-II J04986) sind Glykoproteine mit zwei potentiellen N-Glykosilierungsstellen und einem Molekulargewicht von ca. 24,4 bzw. 26,6 kDa. Die Synthese findet in den Fibroblasten der inneren Hirnhaut statt. Die Namensgebung nach ihrem ersten Fundort in der Ependymalen Zone des Gehirns erwies sich also als unglücklich, so dass auch alternative Namen in der Literatur kursieren, u.a. X-GP und UCC-1. Da die biochemische Funktionsweise bislang ungeklärt ist, besteht dringender Forschungsbedarf. Die starke phylogenetische Divergenz der Ependymin-Familie erschwert dabei ihre funktionelle Analyse. Ependymine werden auch während zentralnervöser Regenerationsprozesse, z.B. nach experimenteller Durchtrennung des Sehnervs, verstärkt synthetisiert. Auch nach Kältestresseinfluss wurde eine erhöhte Ependyminkonzentration beschrieben. Bei anderen Arten als dem Goldfisch wurde eine Expression des Ependymin-Gens auch außerhalb des Zentralen Nervensystems gezeigt. Daher sind weitere Syntheseorte für die Ependymine wahrscheinlich. Weil frühere Versuche zeigten, dass die Konzentration an Ependyminen nach Lernversuchen besonders im Tectum opticum erhöht ist, ist es zunächst von Bedeutung, diese Lokalisation im Elektronenmikroskop zu dokumentieren. In Verbindung mit Lernversuchen an Goldfischen den Tieren, an denen Ependymine zuerst gezeigt wurden sollen hier Verteilungsmuster des Ependymins ultrastrukturell aufgezeigt werden, um der Frage nachzugehen, ob eine Beeinflussung der Synapsen durch Ependymine in diesem visuellen Verarbeitungszentrum der Knochenfische, dem Tectum opticum, stattfinden könnte. In der hier vorliegenden Dissertation sollen Goldfische in einer aktiven Vermeidungsdressur, in einer operanten Belohnungsdressur sowie in einer vestibulomotorischen Aufgabe trainiert werden, ihr Verhalten bestimmten Versuchsbedingungen anzupassen. Eine umfassende technische Beschreibung der verwendeten neuartigen Wechselkammern hilft, das Verhalten der Goldfische beim Vermeidungstraining nachzuvollziehen. Die Ependymin-Verteilung vor und nach diesen Dressuren wird im Tectum opticum, dem visuellen Verarbeitungszentrum im Gehirn von Karpfenfischen, auf ultrastruktureller Ebene in zahlreichen Aufnahmen verfolgt.Zur Betrachtung des Tectum opticum im Transmissionselektronenmikroskop wird das Gehirngewebe von trainierten bzw. untrainierten Goldfischen in ein flüssiges Harz (LR White) gebettet, in sehr dünne Scheiben geschnitten, mit Anti-Ependymin-Antikörpern markiert und schließlich über Gold-gekoppelte Antikörper im Elektronenmikroskop nachgewiesen (so genanntes Postembedding Verfahren). Die optimale Konzentration des hier verwendeten Primärantikörpers wurde in verschiedenen Kontrollexperimenten mit 1:1000 bestimmt.Ultrastrukturelle Aufnahmen zeugen von einem apokrinen bzw. holokrinen Sekretionsweg des Ependymins, das nach der massenhaften Freigabe aus den Fibroblasten direkt über die Basallamina in den extrazellulären Raum des Gehirns (also nach innen) oder über die intermediäre Zellschicht der inneren Hirnhaut in den perimeningealen Raum (also nach außen) sezerniert wird. Die beobachtete und statistisch überprüfte Anlagerung der hydrophilen Ependyminmoleküle an die Zellmembranen von Gliazellen sowie einiger Neurone lässt eine Bindung über einen Membran-Anker, z. B. über eine Palmitoylierung, vermuten. Die Bindung könnte bevorzugt an solche Membranbereiche stattfinden, die infolge regenerativer Veränderungen oder in der Folge pathogener Abwehrprozesse durch eine erhöhte oxidative Belastung gekennzeichnet sind. Abgesehen vom extrazellulären Vorkommen in den laminar aufgebauten Schichten des Tectum opticum, wurde Ependymin auch in den Fortsätzen der Radiärgliazellen und in Lysosomen markiert. Ebenso wurde Ependymin im Zytoplasma und in den Kernen einiger pyramidaler Neurone nachgewiesen, die an der Verarbeitung visueller Informationen beteiligt sind. In früheren Arbeiten wurde mit Preembedding Verfahren eine verstärkte Ependyminbindung an den Synapsen dieser Typ I Neurone beschrieben.Aus bisher unbekannten Gründen konnte die aktive Vermeidungsdressur in der neuartigen Wechselkammer nicht erfolgreich angewendet werden. Daher werden vergleichend mit verhaltensrelevanten Studien mögliche Ursachen für das Ausbleiben einer Konditionierung diskutiert. Ependymins were first detected in 1976 in the ependymal zone of goldfish brain after a behavioural training task. The ependymal zone lines the ventricles of the brain, and it is mainly composed of glial cells. Besides secretory glycoproteins in the brain of various bony fishes, the Ependymin family comprises related proteins in sea cucumbers and genes in numerous animal species down to protozoa, but also up to the Mammalian Ependymin Related Proteins (MERPs) in mammals. Goldfish Ependymins (gene bank accession numbers: gf-I: X 14134 and U00433; gf-II: J04986) are glycoproteins with two potential N-glycosylation sites and molecular weights of 24.4 and 26.6 kDa, respectively. They are synthesized in fibroblasts of the inner endomeninx. As the naming according to their first detection in the ependymal zone didn t prove appropriate, alternative names circulate in the literature, such as X-GP and UCC-1. Because the biochemical mode of action of Ependymins is still not understood to date, there is urgent need for research. The functional analysis is hampered, however, by the large phylogenetic divergence in the Ependymin family.Synthesis of Ependymins is increased during regeneration in the central nervous system (CNS), e. g. after optic nerve crush. A higher concentration of Ependymins was also described after cold stress acclimatisation. In other species, as apposed to goldfish, expression of Ependymin genes was also observed outside the CNS. Therefore, further sites of synthesis of Ependymins are likely to exist. Because earlier experiments have shown that concentrations of Ependymins were particularly increased in the optic tectum after learning events, it is of utter importance to depict this localization by electron microscopy. Here, in the context of learning experiments on goldfish the animals in which Ependymins were detected first , the patterns of Ependymin distribution will be documented ultra-structurally in order to tackle the question whether synaptic interactions in the optic tectum of bony fishes may be mediated by Ependymins. In this PhD-Thesis goldfish are trained to adapt their behaviour to an active avoidance conditioning, an operant awarding conditioning, and a vestibulomotor training task, respectively. A comprehensive technical description of the new shuttle-boxes used may help to understand the behaviour of the goldfish during the active avoidance conditioning. The distribution of Ependymin in the optic tectum, the major visual centre in the brain of cyprinid fishes, is illustrated in numerous ultra-structural pictures, both, before and after training.For observation in the transmission-electron microscope, brain tissue samples of trained and of untrained goldfish, respectively, were embedded in a liquid resin (LR White), cut to ultra thin slices, marked with anti-Ependymin antibodies and detected via gold-conjugated secondary antibodies (so-called postembedding technique). The optimal concentration of the primary antibody as used here was determined to be 1:1000 (as proven by various control experiments).Ultra-structural pictures attest an apocrine or holocrine mode of secretion for Ependymins. From the fibroblasts they are either released across the basal membrane into the extracellular space of the brain parenchyma (i.e., to the inside) or across the intermediate cell layer of the inner endomeninx into the perimeningeal space (i.e., to the outside). The observed and statistically confirmed attachment of the hydrophilic Ependymin molecules to cell membranes of glial cells and of some neurones suggests binding by a membrane anchor, e. g., via palmitoylation. Such binding may preferentially occur at membrane areas that are marked in the sequel of oxidative stress, regenerative transformations, or pathogenic defence mechanisms. Beside the extra-cellular occurrence in various layers of the optic tectum, Ependymins were observed in the processes of the radial glial cells and also in lysosomes. Further, Ependymins were demonstrated in the cytoplasm and in the nuclei of some pyramidal neurons that are involved in the processing of visual information. In earlier work using the preembedding technique an enhanced binding of Ependymin was described at synapses of such type I neurones. For hitherto unknown reasons active avoidance learning in the new shuttle-boxes could not be performed successfully. In comparison with other behavioural studies, possible reasons for the failure of conditioning are discussed.