Molecular characterisation of cytoplasmic phytochrome function in Physcomitrella patens

Abstract

The work presented focussed on the elucidation of cytoplasmic phytochrome function. Physcomitrella patens, a lower plant model system, offered exquisite conditions to access investigation on the cytoplasmic signaling system underlying directional light sensing: a sequenced genome, excellent accessibility of molecular genetics, cellular and microscopic applications and developmental and physiological analysis.Studies using fluorescent fusions proofed phy4 localisation to be sensitive to tag-positioning in Physcomitrella, with predominant cytoplasmic localisation and the ability to enter the nucleus in a light-independent manner. Further localisation studies on higher plant phytochromes phyA and phyB in Physcomitrella and phy4 expression in higher plant cells revealed the existence of a phytochrome nuclear transport machinery in Physcomitrella. As both phyA and phy4 nuclear translocation was affected by tag-positioning this transport mechanism appeared to share features with the fhy1/fhl-transport mechanism acquired by angiosperms and may be considered a ancestor of phytochrome nuclear translocation. In silico analysis of the Physcomitrella genome pointed on a gene probably involved in this mechanism with considerable homology to the C-terminus of FHY1. The assembly of holo-phy4 on PCB-complemented medium resulted in functional phytochrome in yeast cells. Positioning of the BD-tag did not impair phytochrome function but affected binding of putative interactors. Using holo-BD:phy4 four putative interaction partners could be identified from a cDNA library, 2 of which exhibited state-dependent interaction and R/FR-reversibility in Y2H. In silico analysis characterised those putative interactors as (i) a transmembrane protein with ATP / GTP binding function (PLP), (ii) a WD40-domain protein (PRL), (iii) a protein involved in actin filaments binding and cytoskeleton assembly (EF1& #945;) and (iv) an interactor of the heterotrimeric G-protein s alpha subunit (Pirin). Further analysis by sYFP confirmed in vivo interaction of all putative interactors with phy4 within the cytoplasm. Possible functions in phy4 cytoplasmic signaling, however, can only be deduced from in silico analysis and will need further elucidation on the physiological level by analysis of knockdown or knockout mutants. The notion of exclusively cytoplasmic GFP:phy4 and the establishment of functional holo-BD:phy4 in yeast encouraged the investigation of the connection between R and B in directional light sensing in both Physcomitrella and Arabidopsis by assuming a physical interaction between phytochrome and phototropin. Using Y2H assays an interaction of N-terminally tagged phy4 with any of the four described Physcomitrella phototropins was demonstrated, while the reciprocal C-terminal BD-fusion clearly inhibited direct binding of phy4 to phototropin. phy4-phot interaction was additionally shown to be strengthened in a R dependent manner and was further consolidated to be phytochrome-specific. sYFP methods proofed in vivo interaction and simultaneously revealed plasma membrane association of the phy-phot complex in accordance with phototropin localisation previously shown by fluorescent-fusions. The loss of directional R responses in phot knockout mutants confirmed physiological necessity of phy4-phot interaction at the plasma membrane. These results supported the hypothesis of phy4 s plasma membrane fixation with the help of phototropins, thereby not only fulfilling the requirements of the Jaffe/Etzold/Haupt hypothesis but also explaining the intrinsic connection between R and B signaling in directional light sensing of lower plants. The physical interaction of the two photoreceptors is also reflected by the occurrence of neochrome, a phytochrome - phototropin-chimera, twice in evolution. Since a connection of R and B in directional responses has been reported for higher plants too, consequently a phyA-phot1 interaction was hypothesised. Y2H analysis turned out with no direct phyA - phot1 interaction. Astonishingly, an in vivo interaction could still be demonstrated using sYFP methods. In accordance with the notion of the establishment of a more elaborate phytochrome system, especially in regard of phyA, an angiosperm-specific light-labile phytochrome, an indirect, more complex interaction between phyA and phot1 involving other proteins has to be assumed for higher plants. A possible candidate to mediate this complex formation is PKS1. Taken the results of this work together, phytochromes appear to fulfil different functions: (i) as integrators of light in regulation of gene expression by interaction with transcription factors within the nucleus, (ii) as sensors and mediators of directional responses connected to phototropins and thereby associated with the plasma membrane and a yet uncharacterised cytoplasmic signaling cascade and (iii) as regulators of genproduct abundance by tranlationally control as recently reported. Diese Arbeit befasste sich mit Untersuchungen zur cytoplasmatischen Phytochrom Funktion. Physcomitrella patens, ein Modelorganismus niederer Pflanzen, bietet ausgezeichnete Bedingungen zur Untersuchung eines cytoplasmatischen Signaltransduktionssystems direktionaler Lichtwahrnehmung: ein sequenziertes Genom und Zugänglichkeit sowohl molekular-genetischer als auch zellulärer und mikroskopischer Methoden wie auch entwicklungsbiologischer und physiologischer Analyse. Fluoropohor-markierte Proteine zeigten, dass die weitestgehend cytoplasmatische phy4-Lokalisation in Physcomitrella sensibel gegenüber der Fluorophor-Positionierung ist; nukleare Translokation von phy4 ist möglich aber lichtunabhängig. Lokalisationsstudien der Phytochrome phyA und phyB in Physcomitrella sowie Expression von phy4 in höheren Pflanzenzellen zeigten die Existenz eines Kerntransport-Mechanismus für Phytochrom in Physcomitrella. Da sowohl phyA- als auch phy4-Kerntransport durch Fluorophor-Positionierung betroffen waren scheint der vorliegende Transportmechanismus Eigenschaften des Angiospermen fhy1/fhl-Systems zu teilen. In silico Analysen des Physcomitrella Genoms identifizierten ein Genprodukt mit großer Homologie zum FHY1 C-Terminus; möglicherweise spielt dieses Protein eine Rolle innerhalb des nuklearen Transports in Physcomitrella.Holo-phy4-Assemblierung auf PCB-komplettiertem Medium führte zur Bildung funktionellen Phytochroms in Hefezellen. Die Position der Bindedomäne beeinflusste die Phytochromfunktion nicht, beeinträchtigte jedoch die Bindung putativer Interaktoren. Mit Holo-phy4 konnten 4 putative cytoplasmatische Interaktionsproteine aus einer cDNA-library identifiziert werden; zwei dieser Proteine zeigten R-spezifische Interaktion mit phy4 und R/FR-Revertierbarkeit im Y2H-System. In silico Analysen charakterisierten diese Interaktoren als (i) ein Transmembran-Protein mit ATP / GTP bindender Funktion (PLP), (ii) ein WD40-Domänen Protein (PRL), (iii) ein Protein, das an Aktinbindung und Assemblierung des Cytoskeletts beteiligt ist (EF1& #945;) und (iv) als einen Interaktor der Alpha-Untereinheit des heterotrimeren G-Proteins (Pirin). sYFP-Untersuchungen bestätigten die in vivo Interaktion aller putativer Interaktoren mit phy4 im Cytoplasma. Mögliche Funktionen in der cytoplasmatischen phy4-Signaltransduktion können jedoch nur aus in silico Daten abgeleitet werden und bedürfen physiologischer Untersuchungen von knockdown- bzw. knockout-Mutanten. Die Feststellung cytoplasmatisch lokalisiertem GFP:phy4 und des funktionellen holo-BD:phy4 s in Hefe ermunterten zu Untersuchung der Verbindung zwischen R und B innerhalb der Richtungswahrnehmung in Physcomitrella. Y2H-Experimente zeigten eine Interaktion von N-terminal fusioniertem phy4 mit jedem der vier untersuchten Phototropine; reziproke C-terminale Fusionen verhinderten diese Interaktion. Die phy4-phot Bindung konnte als R abhängig und R/FR-revertierbar dargestellt werden. sYFP-Experimente weisten eine in vivo Interaktion nach und offenbarten eine Assoziation des phy-phot-Komplexes an der Plasmamembran im Einklang mit der zuvor bestätigten Plasmamembran-Lokalisation der Physcomitrella Phototropine. Der Verlust direktionaler R-Antworten in phot-Mutanten bestätigte zuletzt auch die physiologische Notwendigkeit des phy-phot-Komplexes an der Plasmamembran. Diese Ergebnisse bestätigen die Plasmamembran-Fixierung von Phytochrom bei der Detektion direktionaler Lichtstimuli und erfüllen damit nicht nur die Vorraussetzungen der Jaffe/Etzold/Haupt-Hypothese sondern erklären auch die enge Verknüpfung von R und B innerhalb direktionaler Antworten in niederen Pflanzen. Die Photorezeptor-Interaktion ist auch reflektiert durch das unabhängige Auftreten von Neochrom, einer genetischen Photorezeptor-Chimäre. Da auch für höhere Pflanzen eine R/B -Verknüpfung direktionaler Antworten besteht, wurde eine Interaktion von phyA mit phot1 vermutet. Y2H-Experimente zeigten jedoch keine direkte phyA-phot1 Interaktion vorliegt. Erstaunlicherweise konnte aber durch das sYFP-System in vivo eine Interaktion an der Plasmamembran nachgewiesen werden. Im Einklang mit dem Auftreten eines komplexeren Phytochrom Systems in höheren Pflanzen, insbesondere des Angiospermen-spezifischen, lichtlabilen phyAs, wird eine indirekte Interaktion von phyA mit phot1 in höheren Pflanzen angenommen, sehr wahrscheinlich unter der Beteiligung weiterer Proteine. Abschließend ist festzustellen, dass Phytochrome mehrere verschiedene Funktionsmodi besitzen: Zum einen als Integratoren von Licht innerhalb der Regulation von Genexpression durch Interaktion mit Transkriptionsfaktoren innerhalb des Zellkerns, außerdem als Sensoren und Vermittler direktionaler Antworten in Verbindung mit Phototropinen an der Plasmamembran und einem, bisher unbekannten, cytoplasmatischen Signaltransduktionssystem und zuletzt in der Regulation von lichtinduzierten Genprodukten auf Ebene tranlationaler Kontrolle, wie jüngst veröffentlicht.