Molecular mechanisms underlying the prevention of glucose-induced life span reduction by the polyphenol quercetin in the mev-1 mutant of Caenorhabditis elegans

Abstract

Ageing is an inevitable process that is often accompanied by the development of mild hyperglycaemia. Besides this physiological type of hyperglycaemia, pathological, more pronounced hyperglycaemia is a hallmark of diabetes mellitus and responsible for its late-onset complications. Polyphenols are a group of secondary plant compounds with preventive effects against glucose-induced degenerative processes.In the present work the mev 1 mutant of the nematode Caenorhabditis elegans was used as model organisms to study the effects of glucose as well as protective effects of the polyphenol quercetin at the molecular level. The mev 1 mutant was used since it displays elevated mitochondrial superoxide generation, which is typical for diabetes, too.It was found that glucose in a concentration of 10 mM significantly reduced the life span measured under heat stress at 37 °& #8202;C. Although glucose led to enhanced generation of reactive oxygen species (ROS) in mitochondria, the scavenging of ROS by ascorbic acid did not prolong life span. Further processes that are discussed to play a role in glucose-induced damage, such as protein carbonylation and formation of advanced glycation end products (AGEs) were not affected by 10 mM glucose. A substantial reduction of the P/O ratio pointed to a reduction of mitochondrial efficiency by glucose. To prove functional losings of mitochondrial proteins, the expression of key proteins of the mitochondrial unfolded protein response (UPRmt) was reduced by RNA interference (RNAi). For example, the knockdown of heat shock proteins HSP-6 and HSP-60, respectively, strongly shortened the life span of mev 1, yet glucose did not cause an additional reduction. It may be concluded that the inhibition of those proteins by glucose is the reason for the observed reduction of life span. Similar results were found after RNAi of proteins of the unfolded protein response in the endoplasmic reticulum (UPRER) or proteasomal protein degradation. Interestingly, RNAi against BEC 1, which is essential for the formation of autophagosomes, completely prevented glucose toxicity but did not affect life span in absence of glucose. It may be assumed that the inhibition of autophagy enhances proteasomal degradation.Apoptosis, on the contrary, does not seem to be relevant for the life span reduction by glucose. This is supported by the finding that RNAi against the Bcl homologue EGL 1 prevents the life span reduction by glucose but does not affect glucose-induced apoptosis.The plant polyphenol quercetin at a concentration of 1 µM prevented the glucose-induced life span reduction completely. RNAi against the identified targets of glucose with respect to life span finally inhibited the life span prolongation by quercetin as well. The Sirtuin SIR-2.1, the nuclear hormone receptor DAF 12 and its putative co-activator MDT 15 were identified as upstream regulators of UPRmt, UPRER, and proteasomal and autophagosomal degradation and are activated by quercetin.In conclusion, the present work demonstrates that enhanced glucose concentrations reduce the life span of the model organism C. elegans. Whereas the formation of ROS, mitochondrial dysfunction, protein carbonylation and generation of AGEs were ruled out as a cause, impairments of proteostasis were identified to be crucial. Quercetin at low micromolar concentrations completely reversed the life span reduction by glucose depending on SIR 2.1, DAF 12, and MDT 15. Those cellular regulators appear to activate the proteostasis network and thereby inhibit the accumulation of proteins damaged by glucose. Alterung ist ein unausweichlicher Prozess der oftmals mit der Entwicklung einer milden Hyperglykämie einhergeht. Neben dieser physiologischen Art der Hyperglykämie, ist die pathologische, stärker ausgeprägte Hyperglykämie ein Kennzeichen des Diabetes mellitus und verantwortlich für dessen Spätfolgen. Polyphenole sind eine Gruppe sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe, denen präventive Wirkungen im Rahmen Glukose-induzierter degenerativer Prozesse zugesprochen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die mev-1 Mutante des Fadenwurms Caenorhabditis elegans als Modellorganismus verwendet, um die Effekte der Glukose sowie protektive Wirkungen des Polyphenols Quercetins auf molekularer Ebene zu untersuchen. Die mev 1 Mutante wurde verwendet, da sie vermehrte mitochondriale Superoxid-Bildung aufweist, die auch typisch für Diabetes ist.Es konnte gezeigt werden, dass Glukose ab einer Konzentration von 10 mM die Lebensspanne unter Hitzestress bei 37 °& #8202;C signifikant verminderte. Glukose führte zwar zur erhöhten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies in Mitochondrien, deren Abfangen durch Zugabe von Ascorbinsäure bewirkte allerdings keine Lebensverlängerung. Weitere im Rahmen Glukose-bedingter Schädigung diskutierte Prozesse, wie Proteincarbonylierung und die Bildung von advanced glycation end products (AGEs), wurden durch 10 mM Glukose nicht beeinflusst.Eine deutliche Abnahme des P/O-Quotienten wies auf eine Reduktion mitochondrialer Effizienz durch Glukose hin. Um funktionelle Einbußen mitochondrialer Proteine durch Glukose nachzuweisen wurden zentrale Proteine der mitochondrialen unfolded protein response (UPRmt) in ihrer Expression mittels RNA-Interferenz (RNAi) reduziert. Dabei zeigte sich beispielsweise, dass der knockdown der Hitzeschockproteine HSP 6 bzw. HSP-60 die Lebensspanne von mev 1 drastisch reduzierte, Glukose aber keine weitere Verkürzung der Lebensdauer bewirkte. Daraus lässt sich schließen, dass eine Hemmung solcher Proteine durch Glukose die beobachtete Lebenszeitverkürzung bewirkt. Ähnliche Ergebnisse ergaben sich nach RNAi von Proteinen der unfolded protein response im endoplasmatischen Retikulum (UPRER) oder des proteasomalen Abbaus. Interessanterweise verhinderte RNAi gegenüber dem für die Autophagosomenbildung essentiellen Faktor BEC 1 vollständig die Glukosetoxizität ohne die Lebensspanne in Abwesenheit von Glukose zu beeinflussen. Vermutet werden kann eine Steigerung des proteasomalen Abbaus bei Hemmung der Autophagosomenbildung.Apoptose scheint hingegen keine Bedeutung für die Lebenszeitverkürzung durch Glukose zu spielen. Dafür spricht, dass die Verminderung der Expression des Bcl-Homologs EGL 1 die Lebenszeitverkürzung durch Glukose verhinderte ohne die Glukose-induzierte Apoptose zu beeinflussen.Das Pflanzenpolyphenol Quercetin unterdrückte in einer Konzentration von 1 µM die Glukose-induzierte Lebenszeitverkürzung vollständig. RNAi identifizierter Zielproteine der Glukose mit Relevanz für die Lebensspanne verhinderte schließlich auch die Lebensverlängerung durch Quercetin. Als übergeordnete Regulatoren der UPRmt, UPRER sowie des proteasomalen und autophagosomalen Abbaus, die durch Quercetin aktiviert werden, konnten das Sirtuin SIR-2.1, der nukleäre Hormonrezeptor DAF-12 sowie dessen putativer Co-Aktivator MDT-15 identifiziert werden.Zusammenfassend wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass erhöhte Glukosekonzentrationen die Lebensspanne des Modellorganismus C. elegans vermindern. Während die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies, mitochondriale Dysfunktion, Proteincarbonylierung und AGE-Bildung als Ursache der Lebensverkürzung ausgeschlossen werden konnten, wurde die Störung der Proteostase als essentiell dafür identifiziert. Mikromolare Quercetin-konzentrationen verhinderten die Verkürzung der Lebensspanne durch Glukose vollständig in Abhängigkeit von SIR 2.1, DAF 12 und MDT 15. Diese zellulären Regulatoren aktivieren offensichtlich das Proteostase-Netzwerk und verhindern dadurch die Akkumulation Glukose-geschädigter Proteine.