Characterization and S-glutathionylation of hexokinase from the malaria parasitePlasmodium falciparum

Abstract

Tropical malaria caused by the unicellular apicomplexan parasite Plasmodium is still a major threat to human health and welfare in tropical and subtropical regions of the world. In the past decades, both the emergence of antimalarial resistance of Plasmodium and insecticide-resistance in the mosquito vector made the situation more and more severe. The progress in developing a malaria vaccine, in identifying new drug targets, and in developing novel antimalarials is slow. Hexokinase represents a central enzyme of glucose metabolism in the malaria parasite P. falciparum. Due to the high glucose dependence of the parasite, studying hexokinase can enhance our knowledge of central metabolic processes in Plasmodium and contribute to the search for new antimalarial drug targets. In this thesis, I have therefore studied hexokinase (PfHK) from P. falciparum including its kinetic properties as well as its redox regulation.First, PfHK has been successfully cloned, heterologously overexpressed in Escherichia coli and purified to homogeneity. Gel filtration indicated that recombinant PfHK is present as a tetramer. Kinetic studies showed relatively low affinities for the substrates glucose and ATP when compared with the human homologues. In contrast to the common 50-kDa hexokinases in other species, PfHK can be inhibited by G6P. Two constructs of GFP fused PfHK (full-length and C-terminally truncated) were generated and revealed that the sub-cellular localization of PfHK is cytosolic in P. falciparum. The data furthermore showed that the C-terminal hydrophobic region in PfHK does not seem to lead to membrane association of the protein. In order to obtain crystals of PfHK and solve its three-dimensional structure, more than 500 crystallization conditions were tested. Although no high quality crystals have been obtained so far, the screening seems to be worth of further optimization. To gain first structural insights, a model of PfHK was generated based on the structure of human hexokinase I (PDB ID: 1DGK). Three insertions were found on the surface of PfHK when comparing the structure with its human counterpart, which might provide a basis for selective inhibitor development.In a second focus of my work, I studied the redox regulation of PfHK, which had been shown to be a target of members of the thioredoxin superfamily and of S-glutathionlylation. Thioredoxin-related proteins (thioredoxin 1, glutaredoxin and plasmoredoxin of P. falciparum) slightly enhanced the activity of PfHK. Similar results were obtained with DTT incubation which indicates an underlying reductive mechanism. Furthermore PfHK was inhibited by S-glutathionylation, an effect that could be partially reversed by DTT. Different incubation conditions with glutathione were tested and anti-GSH antibodies were used to probe S-glutathionylation. After trypsin digestion, a clear mass increase of ~305 Da was observed in several cysteine- containing peptides by MALDI-TOF. S-glutathionylation was reproducibly found on Cys21, Cys249, Cys236, and Cys346. Thirdly, to validate PfHK as a drug target in P. falciparum, I started to generate a PfHK knockout strain. For this purpose, first a merodiploid strain was constructed which can episomally express PfHK. The transgenic parasites were obtained and in a next step the knockout of endogenous PfHK will be performed.The experiments performed in this study represent important steps towards characterizing PfHK as a potential target of novel antimalarial compounds. Tropische Malaria, die durch den einzelligen Parasiten der Gattung Apikomplexa, Plasmodium, verursacht wird, stellt weiterhin eine große Bedrohung für Gesundheit und Wohlergehen der Menschen in tropischen und subtropischen Regionen der Welt dar. In den vergangenen Jahrzehnten haben sowohl die Verbreitung von Resistenzen des Malariaerregers gegen eingesetzte Medikamente, als auch Pestizidresistenzen der Vektormücke die Situation ständig verschlechtert. Der Fortschritt in der Entwicklung von Impfstoffen, in der Identifizierung von neuen Angriffspunkten für Medikamente und in der Entwicklung von neuen Medikamenten gegen Malaria geht nur langsam voran. Die Hexokinase repräsentiert ein zentrales Enzym in dem Glukosemetabolismus des Malariaparasiten P. falciparum. Infolge der hohen Glukoseabhängigkeit des Parasiten kann die Erforschung der Hexokinase dazu beitragen, zentrale metabolische Prozesse in Plasmodium zu verstehen und neue Ziele für die Entwicklung neuer Medikamente gegen Malaria zu finden. Deshalb habe ich in meiner Arbeit die Kinetik und Redoxregulation der Hexokinase aus Plasmodium falciparum untersucht.Als erstes wurde PfHK kloniert, in Escherichia coli heterolog überexprimiert und gereinigt. Die Gelfiltrationschromatografie weist darauf hin, dass die rekombinante PfHK als Tetramer vorliegt. Kinetische Untersuchungen zeigen, im Vergleich zu dem humanen Homolog, eine relativ geringe Affinität zu den Substraten Glukose und ATP. Im Gegensatz zu den üblichen 50-kDa-Hexokinasen in anderen Spezies, kann PfHK durch G6P gehemmt werden. Es wurden zwei Fusionskonstrukte aus GFP und PfHK (full-length und C-terminal verkürzt) hergestellt, die erkennen lassen, dass PfHK im Zytosol von P. falciparum lokalisiert ist. Des Weiteren zeigten die Daten, dass die C-terminale hydrophobische Region der PfHK nicht zu einer Membranassoziation des Proteins führt. Um Kristalle der PfHK zu erhalten und die dreidimensionale Struktur aufzulösen, wurden mehr als 500 Kristallisationsbedingungen getestet. Obwohl bisher keine hochqualitativen Kristalle erhalten wurden, Wird es sich lohnen, das Screening weiter zu optimieren. Um erste Kenntnisse über die Struktur zu gewinnen, wurde ein Modell basierend auf der Struktur der humanen Hexokinase I (PDB ID: 1DGK) erstellt. Im Vergleich mit dem humanen Gegenstück wurden drei Insertionen auf der Oberfläche der PfHK gefunden, die eine Basis für die Entwicklung selektiver Inhibitoren darstellen könnten. Ein zweiter Fokus meiner Arbeit richtete sich auf die Redoxregulation der PfHK, von der gezeigt wurde, dass sie ein Angriffspunkt von Mitgliedern der Thioredoxinsuperfamilie und der S-Glutathionylierung ist. Thioredoxin-verwandte Proteine (Thioredoxin 1, Glutaredoxin und Plasmoredoxin von P. falciparum) erhöhen leicht die Aktivität der PfHK. Ähnliche Ergebnisse wurden durch die Inkubation mit DTT erhalten, was dafür spricht, dass ein reduktiver Mechanismus zugrunde liegt. Des Weiteren wurde die PfHK durch S-Glutathionylierung gehemmt, einen Effekt, der teilweise durch DTT reversibel ist. Es wurden verschiedene Inkubationsbedingungen mit Glutathion getestet und anti-GSH-Antikörper genutzt um die S-Glutathionylierung zu untersuchen. Nach dem Trypsinverdau wurde eine Masse von ~305 Da in verschiedenen Cystein-enthaltenden Peptiden durch MALDI-TOF beobachtet. S-Glutathionylierung wurde reproduzierbar in Cys21, Cys249, Cys236 und Cys346 gefunden.Drittens, um PfHK als Ziel für Medikamente gegen P. falciparum zu validieren, habe ich angefangen einen PfHK knockout-Stamm herzustellen. Für diesen Zweck wurde zunächst ein merodiploider Stamm konstruiert, der episomal PfHK exprimiert. Die transgenen Parasiten sind vorhanden und in einem nächsten Schritt wird der knockout des endogenen PfHK durchgeführt werden. Die Experimente, die in dieser Studie durchgeführt wurden sind wichtige Schritte auf dem Weg zur charakerisierung der PfHK als Ziel für neuartige Antimalariamittel.