Gonadenspezifische Transkriptionsanalysen und erste Charakterisierungen von Transmembranrezeptoren aus Schistosoma mansoni

Abstract

Motiviert durch die enormen sozioökonomischen Folgen der Schistosomiasis in tropischen und subtropischen Endemiegebieten weltweit werden derzeit große Anstrengungen unternommen, die Verbreitung der parasitären Infektionskrankheit einzudämmen. Auf der Suche nach alternativen Behandlungsmethoden zu den gegenwärtig limitierten Therapieansätzen, ist u.a. ein fundiertes Wissen über die Entwicklungsbiologie von Schistosomen unerlässlich. Ziel meines Promotionsvorhabens war es daher, einen Beitrag zur Aufklärung zentraler Signalprozesse aus S. mansoni zu leisten, die im Zusammenhang mit der Entwicklung und Differenzierung des Parasiten stehen. Ein Schwerpunkt lag dabei auf den molekularen Mechanismen, welche der paarungsinduzierten Reifung adulter Schistosomen zugrunde liegen. Diese sind im Hinblick auf die Fortpflanzung und Aufrechterhaltung des Lebenszyklus, aber auch wegen der Rolle der Eier bei der Induktion pathologischer Prozesse, von besonderer Bedeutung. Im Fokus meiner Untersuchungen standen verschiedene Transmembranrezeptoren, die aufgrund ihrer Homologie zu entwicklungsbiologisch relevanten Genen anderer Organismen möglicherweise bereits beschriebenen gonadenspezifischen Signalwegen aus S. mansoni voran gestellt sind. Die Untersuchung gewebespezifischer Genfunktionen in adulten S. mansoni wird allerdings durch einen eingeschränkten Zugriff auf innere Organe wie die Gonaden erheblich erschwert. Ein erstes Ziel war es daher, ein Protokoll zur Isolation von Testes und Ovarien aus adulten S. mansoni zu etablieren, um Transkriptionsanalysen auf der Ebene von Organen durchführen zu können. Über eine Kombination aus Detergenzien- und Proteasebehandlung gelang es, Testes und Ovarien aus paarungserfahrenen und unerfahrenen S. mansoni zu erhalten. Hieran anknüpfende Analysen zeigten weiterhin, dass die isolierten Gonaden vitale Zellen und RNA in ausreichender Menge und Qualität für nachfolgende molekularbiologische Anwendungen enthielten. Um eine Anwendbarkeit der Methode für gewebespezifische Transkriptionsanalysen zu belegen, wurden erste RT-PCRs mit RNA aus Testes und Ovarien paarungserfahrener S. mansoni durchgeführt. Die hierbei erzielten Resultate bestätigten und/oder ergänzten frühere Studien ausgewählter Gene bezüglich einer Transkription in den Gonaden und lieferten außerdem erste Hinweise auf die Transkription weiterer, bisher nicht untersuchter Gene in diesen Organen. Damit erwies sich dieser Ansatz als geeignet, Ergebnisse anderer, wesentlich zeitaufwendigerer Lokalisationsmethoden, wie in situ Hybridisierungen zu verifizieren und aufgrund der höheren Sensitivität organspezifischer RT-PCRs zu ergänzen oder zu ersetzen.Im zweiten Teil der Arbeit wurden daher gonadenspezifische RT-PCRs in Kombination mit in situ Hybridisierungen angewendet, um die Transkription ausgewählter Transmembranrezeptoren in Testes und Ovarien adulter S. mansoni nachzuweisen. Zusätzlich wurden erstmals Transkriptionsanalysen mittels qPCRs durchgeführt, um Hinweise auf paarungsabhängige Transkriptionsmuster verschiedener Rezeptorgene auf Ebene der Gonaden zu untersuchen. Die erhaltenen Ergebnisse belegten erstmals den Einfluss des Paarungskontakts auf die Genexpression von Testes und Ovarien adulter S. mansoni. So konnten eine Reihe interessanter Kandidaten identifiziert werden, deren Transkriptionsraten teilweise erheblich durch die Paarung beeinflusst werden, wie das Frizzled-Homolog SmFrz1 und der Neuropeptidrezeptor SmNPYR1.Den dritten Teil der Arbeit bildeten weiterführende Charakterisierungen einiger dieser Rezeptorgene in adulten S. mansoni mittels funktioneller Analysen wie Inhibitorstudien oder RNAi-Experimenten. So konnten das transmembrane Mucin SmTmMuc1 und SmNPYR1 aufgrund von morphologischen Veränderungen in Ovarien bzw. Testes nach RNAi knock down Experimenten mit einer Beteiligung an der Gametogenese adulter S. mansoni in Verbindung gebracht werden. Ebenfalls an gonadenspezifischen Signalwegen beteiligt sind darüber hinaus möglicherweise die FGFR-Homologe SmFGFR1 und SmFGFR2, deren Inhibition zu einer Reduktion der Eiproduktion adulter S. mansoni führte. SmFrz1 hingegen scheint morphologischen Eianalysen nach Inhibitor- und RNAi-Experimenten zufolge für frühe Entwicklungsprozesse von Bedeutung zu sein, da entsprechende Behandlungen mit Defekten in der Embryogenese einhergingen. Darüber hinaus ergaben die Identifizierung potentiell Progesteron-bindender Transmembranrezeptoren und erste in vitro Behandlungen mit diesem Steroidhormon Hinweise auf eine reproduktionsrelevante Rolle von Progesteron oder verwandten Verbindungen in adulten S. mansoni. Zusammengefasst erweitern die vorliegenden Ergebnisse bisher untersuchte Signalprozesse in den Gonaden adulter S. mansoni um weitere Signalmoleküle in Form von Transmembranrezeptoren unterschiedlicher Proteinfamilien. Aufgabe zukünftiger Studien wird es u.a. sein, downstream-Interaktionspartner dieser Rezeptoren zu identifizieren und sie so in das Gesamtbild gonadenspezifischer Signalwege zu integrieren. Unter Berücksichtigung der Sonderstellung von Transmembranrezeptoren bei der Vermittlung extra- und intrazellulärer Signale und ihrer medizinischen Relevanz als potentielle drug targets, eröffnen sich durch eine Identifizierung ihrer Liganden sowie weiterer Aufklärung ihrer biologischen Funktionen neue Perspektiven zur Bekämpfung der Schistosomiasis. Motivated by the tremendous socioeconomic consequences of schistosomiasis in tropic and sub-tropic endemic areas worldwide, many efforts are currently made to control this disease. Searching for alternative medical treatments to complement or replace present therapies requires fundamental knowledge of the schistosome biology. Therefore, the aim of my PhD thesis was to contribute to the elucidation of central signaling processes involved in development and differentiation of the parasite. Those molecular mechanisms were of main interest, which are part of the pairing-induced sexual maturation of adult schistosomes. This phenomenon is of outstanding relevance with respect to the role of eggs for maintaining the life cycle but also for inducing pathogenesis. My work concentrated on different classes of transmembrane receptors which, due to their homology to developmentally important genes of other organisms, are interesting candidates for interactions with molecules already described to be involved in gonad-specific signaling pathways of S. mansoni. The investigation of tissue-specific gene activities in S. mansoni is limited by the restricted access to inner organs like the gonads. Therefore, the first aim of my study was the establishment of a protocol suitable for the isolation of testes and ovaries of adult S. mansoni to perform transcriptional analyses at the organ level. Using a combination of detergent and protease treatment it was possible to get access to ovaries and testes of pairing-experienced and -unexperienced worms. Subsequent analyses showed that isolated gonads contained vital cells and RNA in sufficient amounts and quality for subsequent molecular applications. To confirm the usefulness of the method for tissue-specific transcriptional analyses first RT-PCRs with RNA from isolated testes and ovaries of pairing-experienced S. mansoni were preformed. First, the results confirmed and/or completed former localization studies of selected genes with respect to their transcription in the gonads. Secondly, first hints were obtained for gonad-specific transcriptional activity of genes, which had not been characterized so far. Taken together, this approach is suitable to verify results of more time-consuming localization methods such as in situ hybridization, and even to complete or replace them due to the high sensitivity of the organ RNA-based RT-PCR reactions. In the second part of this work a combination of gonad-specific RT-PCRs and in situ hybridizations was used to detect the localization of transcripts of different transmembrane receptor genes in testes and ovaries of adult S. mansoni. Additionally, first transcriptional analyses by qPCRs were performed to investigate pairing-dependent transcription patterns of different receptor genes at the gonad level. The obtained results proved the influence of the pairing contact on gene expression in testes and ovaries of adult schistosomes for the first time. This led to the identification of several interesting candidates whose transcriptional profiles were in part considerably influenced by pairing, like the Frizzled-homolog SmFrz1 and the neuropeptide receptor SmNPYR1. The third part of this study dealt with further characterizations of some of these transmembrane receptor genes in adult S. mansoni by functional analyses such as inhibitor treatments or RNAi experiments. The transmembrane mucin SmTmMuc1 and SmNPYR1 were found to be involved in gametogenesis since morphological changes were observed in ovaries or testes upon RNAi knockdowns. The two FGFR homologs SmFGFR1 and SmFGFR2 are possibly also part of gonad-specific signaling pathways as an inhibition of FGFR-signaling in S. mansoni couples led to a reduction of egg synthesis. In contrast to this, SmFrz1 seems to be an important factor for early processes in development as the results of egg-morphology analyses following inhibitor studies and/or RNAi experiments pointed to incomplete embryogenesis. Additionally, the identification of two potential progesterone-binding transmembrane receptors as well as an initial in vitro treatment with this steroid hormone provided first hints of a role of progesterone, or closely related compounds, on processes involved in sexual reproduction of the parasite. Summarizing the present results of this work, interesting new transmembrane receptor genes representing different protein families were identified, which extends the knowledge about known signaling processes in the gonads of adult S. mansoni. Among others, future challenges are to identify downstream interaction-partners of those receptors to integrate them in the overall picture of gonad-specific signaling pathways. With respect to the exceptional position of transmembrane receptors in the mediation of extracellular and intracellular signaling processes and their medical relevance as potential drug targets, the identification of their ligands and further elucidation of their biological functions may open new perspectives for fighting schistosomiasis.