The role of the non-canonical IKK complex in glioblastoma multiforme

Abstract

Glioblastoma multiforme is one of the most common and lethal brain tumors. Many genetic and molecular changes have been described to occur in this type of brain cancer. Within this work, the role of the non-canonical IKK complex in glioblastoma multiforme was investigated. The non-canonical IKK complex is composed of the IKK-related kinases TBK1 and IKK& #949; as well as adaptor proteins such as TANK, and is usually involved in the defense against viral and bacterial pathogens by the induction of type I interferon expression. This work shows, that TANK is dysregulated and over-expressed in a wide range of GBM patient tissue samples as well as glioma cell lines. Several mechanisms have been found to be responsible for the greatly varying protein levels of TANK. Various experimental approaches showed, that differences in the de novo transcription of the Tank gene and differential stabilities of TANK mRNAs account for the variances in TANK protein levels in glioma cell lines. The influence of members of the non-canonical IKK complex on cellular functions of glioma cell lines was then investigated after the knock-down of TANK or TBK1. Proliferation assays as well as MTT assays revealed a markedly reduced proliferation rate of some glioma cell lines after silencing of TANK or TBK1. The proliferation of other glioma cells was dependent on either TANK or TBK1. The proliferation of the minority of glioma cell lines was not affected by the knock-down of TANK or TBK1. Additionally, the ability of glioma cells to progress in cell cycle was found to be reduced upon TANK or TBK1 knock-down in those glioma cell lines where the knock-down caused a reduced proliferation ability. The migration ability was examined by wound-healing assays. These experiments showed that cells, which depend on TANK or TBK1 for proliferation, also need these proteins for cell migration. Usually those cellular functions are regulated by signaling pathways such as the Ras-Raf-MEK-ERK or PI3K-Akt signaling pathways. Therefore, the involvement of the non-canonical IKK complex in those signaling cascades was determined in this work. Akt as well as ERK1/2 have been shown to be constitutively phosphorylated and activated in some primary tissue samples of GBM or astrocytoma grade III patients as well as most of the glioma cell lines. The knock-down of either TANK or TBK1 as well as the inhibition of both IKK-related kinases (TBK1 and IKKepsilon) by BX795 had a repressive effect on those phosphorylations in some of the glioma cell lines. Thus, an alternative signaling path for the activation of proliferation and survival signals in glioblastoma multiforme was identified which is dependent on the cell line. A pharmacological approach was applied to study the complex signaling network in detail and revealed a negative feedback loop from MEK1/2 to Akt as well as a MEK-independent signaling pathway to activate ERK. Whether the MEK-independent TBK1/IKKepsilon-Akt signaling axis leads to the phosphorylation and activation of ERK directly or indirectly still needs to be clarified in the future. However, this TBK1/IKKepsilon-Akt-ERK pathway represents an alternative pathway to activate proliferation and survival signals in cancer, thus providing new opportunities in the discovery of treatments of glioblastoma multiforme. Das Glioblastom zählt nachwievor zu einem der häufigsten und tödlichsten Hirntumoren. Bisher konnten einige genetischen und molekularen Veränderungen in diesem Tumor identifiziert werden, die für diese Tumorart charakteristisch sind. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle des nicht kanonischen IKK Komplex im Glioblastom zu charakterisieren. Der nicht kanonische IKK Komplex besteht aus den beiden Kinasen TBK1 und IKK& #949;, die durch ein Adaptorprotein wie beispielsweise TANK zusammengehalten werden. In erster Linie ist der Signalweg über diesen Komplex für die Reaktion auf virale oder bakterielle Pathogene verantwortlich, und führt in dieser Folge zur Ausschüttung von Typ I Interferonen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Expression des Adaptorproteins TANK in einer Vielzahl von Patienten und Gliomzelllinien dereguliert und erhöht ist. Dabei wurden eine unterschiedliche de novo Transkription und mRNA Stabilität als mögliche Ursachen für die schwankenden Proteinlevel von TANK in den Gliomzelllinien gefunden. Weiterhin wurde die Rolle des nicht kanonischen IKK Komplexes auf zelluläre Funktionen der Gliomzelllinien untersucht, indem das Adaptorprotein TANK sowie die Kinase TBK1 retroviral herunter reguliert wurden. Dabei verdeutlichten Proliferationsstudien und MTT-Tests eine deutlich reduzierte Proliferationsfähigkeit in einigen Gliomzelllinien. In anderen Gliomzelllinien war die Proliferation abhängig von TANK oder TBK1, und in einigen wenigen Zelllinien hatten beide Proteine keinen Einfluss auf die Proliferation. Auch der Zellzyklusverlauf war in den Gliomzelllinien vermindert, in denen der Knock-down von TANK oder TBK1 zu einer reduzierten Proliferation führte. Des Weiteren wurde die Abhängigkeit der Zellmigration von TANK und TBK1 mittels Wound-healing Experimente in Gliomzelllinien untersucht und zeigte, dass in einigen Zelllinien auch diese TANK und TBK1 benötigt. Grundsätzlich werden Zellfunktionen durch verschiedene Signalwege wie beispielsweise den Ras-Raf-MEK-ERK- oder den PI3K-Akt-Signalweg reguliert. Deshalb wurde der Einfluss des nicht kanonischen IKK Komplexes auf diese Signalwege untersucht. Zunächst wurde festgestellt, dass sowohl Akt als auch ERK1/2 in einigen Gliomen und den meisten Gliomzelllinien konstitutiv phosphoryliert und damit aktiviert sind. Der Knock-down von TANK bzw. TBK1 wie auch die Inhibierung beider Kinasen (IKKepsilon und TBK1) durch BX795 führte in einigen Gliomzelllinien zu einer Reduzierung dieser Phosphorylierungen. Damit konnte ein alternativer Signalweg aufgezeigt werden, der zu einer Aktivierung von Proliferations- und Überlebenssignalen in einigen Gliomzelllinien führt. Um einen genaueren Einblick in die komplexe Vernetzung der beteiligten Signalwege zu bekommen, wurde ein pharmakologischer Ansatz gewählt. Hierbei wurden eine negative Rückkopplung von MEK1/2 zu Akt gefunden sowie ein ERK1/2-aktivierender Signalweg, der unabhängig von MEK1/2 ist. Inwiefern dieser TBK1/IKKepsilon-Akt-Signalweg direkt oder indirekt zur Phosphorylierung und Aktivierung von ERK1/2 führt, muss noch in weiterführenden Experimenten untersucht werden. Dennoch stellt der Signalweg eine Alternative zur Aktivierung von Proliferations- und Überlebenssignalen in Krebszellen dar, und liefert damit neue Möglichkeiten für die Entwicklung von Therapien zur Behandlung des Glioblastoms.