Identification and Characterization of Bronchioalveolar Stem Cells and Oct4 Positive Cells in Adult Mouse Lung

Abstract

Bronchioalveolar stem cells (BASCs) have been shown to be a regional stem cell population in the distal lung. They are CCSP (Clara cell secretory protein) and SPC (surfactant protein C) positive. They respond to bronchiolar and alveolar injuries. BASCs are thought to maintain the bronchiolar Clara cells and the alveolar type 2 cells. Previous studies showed that Clara cells contribute to the renewal of the bronchiolar epithelium after oxidant mediated damages. Importantly, after the depletion of Clara cells through administration of naphthalene, residual cells of terminal bronchioles were fully capable of epithelial renewal and restoration. These naphthalene-resistant Clara cells were present at the bronchioalveolar duct junction (BADJ). BASCs were isolated based on positive staining for CD34, a marker for skin epithelial cells and hematopoietic stem cells, and for Sca-1, a marker for stem cells. Others studies performed in adult mouse lung indicate that Sca-1pos cell fractions are predominantly representative of mesenchymal cell lineages. This highlights that Sca-1 is not a selectable marker for epithelial stem cells in the adult murine lung, and therefore the need of alternative functional assays for the identification and characterization of BASCs. In the present study, we characterized BACS by alternative methods. We identified by immunofluorescence the proposed BASC cell population co-expressing SPC, a marker for alveolar type 2 cells, and CCSP, a marker for bronchial epithelial Clara cells, that resides at the BADJ. BASCs were then identified by flow cytometry using double-fluorescent Cre reporter mice that express YFP and mCherry under the control of SPC and CCSP promoters; also based on an adjusted McQualter protocol for their expression of EpCAMhigh and CD24low. Clonogenic assays of EpCAMhigh and CD24low sorted cells cultured on feeders and matrigel showed BASCs as small colony-forming-units. The proliferative activity of BASCs after naphthalene injury and pneumonectomy was also determined. Based on their expression of EpCAMhigh-CD24low, we showed the evidence of BASCs as a potential progenitor/stem cells for distal murine lung. We further aim to establish in vivo differentiation assays for BASCs to address changes in stemness and proliferative activity during experimental lung disease and lung regeneration.Oct4, specifically expressed in embryonic stem cells, can also be detected in adult stem cells such as bone marrow-derived mesenchymal stem cells. A role for maintaining pluripotency and self-renewal of embryonic stem cells is ascribed to Oct4 as a pluripotency marker. Several studies suggest a role for Oct-4 in sustaining self-renewal capacity of adult somatic stem cells. Other scientists have produced the evidence that Oct-4 gene ablation in the somatic stem cells revealed no abnormalities in homeostasis or regenerative capacity. Data strongly argue that Oct-4, even if expressed at low levels in somatic cells, is dispensable for the self-renewal of somatic stem cells, for tissue homeostasis, and for the regeneration of tissue in the adult. The aim of this project was to trace Oct4 positive cells in adult mouse lung. We identified a distinct pulmonary Oct4 expressing cell compartment that belongs based on its localization to telocytes. The hypothesis is supported from the literature reporting that telocytes are located in the perivascular wall and extended by their telopodes to the peribronchial and alveolar spaces. They express Oct-4, vimentin, Sca-1, PDGFR-beta, C-kit and VEGF. We confirmed these results by immunofluorescence confoncal microscopy of adult wild type mouse lung. Flow cytometric analyses using Oct4-GFP reporter mice identified a population of Oct4-GFP positive cells. Oct4-GFP positive cells were sorted cultured and were growing with long extensions like telocytes. Laser capture microdissection and qRT-PCR were also established to support immunofluorescence data on mRNA level. Since our data confirmed the hypothesis in which Oct4 positive cells are telocytes, our next goal is first to study the role of telocytes in adult mouse lung and determine the function of Oct4 in these cells. Bronchioalveolare Stammzellen wurden als eine regionale Stammzellpopulation in der distalen Lunge charakterisiert. Sie sind CCSP (Clara cell secretory protein) und SPC (surfactant protein C) positiv und reagieren bei bronchiolaren und alveolaren Verletzungen. Es wird vermutet, dass die BASCs den Bestand bronchiolarer Clara Zellen und der Alveolaren Typ II Zellen aufrechterhalten. Vorangegangene Studien haben gezeigt, dass Clara Zellen nach der Schädigung durch oxidativen Stress zur Erneuerung des bronchiolaren Epitheliums beitragen. Erwähnenswert ist, dass nach der Entfernung von Clara Zellen durch die Gabe von Naphtalen die verbliebenen Zellen im terminalen Bronchiolus in der Lage sind, das Epithel vollständig wiederherzustellen. Diese Naphtalen-resistenten Clara Zellen sind in den bronchioalveolaren Verbindungen, den sogenannten bronchioalveolar duct junctions (BADJ) lokalisiert. BASCs werden durch eine Positivfärbung für CD34, einem Marker für Hautepithelzellen und hämatopoetische Stammzellen sowie eine Positivfärbung für Sca-1, einem Marker für Stammzellen, isoliert. Andere in der Maus durchgeführte Studien deuten darauf hin, dass Sca-1pos Zellfraktionen überwiegend mesenchymale Zelllinien repräsentieren. Das wiederum zeigt, dass Sca-1 kein selektiver Marker für epitheliale Stammzellen in der adulten Mauslunge ist. Daher ist es notwendig, alternative funktionale Assays zur Charakterisierung von BASCs zu etablieren. In der hier vorliegenden Studie werden die BASCs mit Alternativmethoden charakterisiert. Die durch die Koexpression von SP-C, dem Marker für alveolare Typ II Zellen, und CCSP, dem Marker für bronchiolare epitheliale Clara Zellen, definierte BASC Zellpopulation wurde mittels Immunofluoreszenz in den BADJ lokalisiert. Weiterhin wurden die BASCs mit Hilfe der Durchflusscytometrie identifiziert. Hierbei wurde eine Cre-Reportermauslinie verwendet, die eine Doppelfluoreszenz aus YFP und mCherry unter der Kontrolle der Promotoren für SPC und CCSP ausbildete, sowie ein angepasstes McQualter Protokoll für die Expression von EpCAMhighCD24low in BASCs. Klonogene Assays für diese auf EpCAMhighCD24low isolierten Zellen, die auf Futter-Zellen und Matrigel kultiviert wurden, zeigten BASCs als kleine, koloniebildende Einheiten. Die Proliferationsaktivität der BASCs nach einer Naphtalenbehandlung und Pneumonektomie wurde ebenfalls ermittelt. Basierend auf der EpCAMhighCD24low Expression in den BASCs konnte bewiesen werden, dass diese Zellen potentielle Stammzellen für die distale Mauslunge darstellen. Weiterhin soll ein in vivo Differenzierungs-Assay für BASCs etabliert werden, um die Veränderungen in der Stammzell-und Proliferationsaktivität während experimentell induzierter Lungenerkrankungen und Lungenregeneration zu untersuchen. Oct4, das spezifisch in embryonalen Stammzellen exprimiert wird, kann ebenfalls in adulten Stammzellen detektiert werden, dort z. B. in mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark. Oct4 wird als Pluripotenz-Marker charakterisiert, wobei ihm eine Rolle in der Erhaltung von Pluripotenz und Selbsterneuerung embryonaler Stammzellen zugesprochen wird. Verschiedene Studien lassen vermuten, dass Oct4 zur Beibehaltung der Selbsterneuerungsfähigkeit adulter somatischer Stammzellen beiträgt. Andere Studien hingegen zeigen, dass eine Ausschaltung des Oct4 Gens in somatischen Stammzellen keine Anomalitäten in der Homöostase oder der Regenerationsfähigkeit dieser Zellen zur Folge hat. Einige Daten deuten sehr stark darauf hin, dass Oct4, auch wenn es in geringfügig in somatischen Zellen exprimiert wird, für die Selbsterneuerungsfähigkeit von somatischen Stammzellen, Gewebehomöostase und für die Regeneration von Gewebe in Adulten entbehrlich ist. Das Ziel dieses Projektes war die Detektion von Oct4+ Zellen in der adulten Mauslunge. Es konnte eine distinkte, Oct4 exprimierende Zellpopulation identifiziert werden, die auf Grund ihrer Lokalisation den Telozyten zugeordnet wurde. Diese Hypothese wird durch die Literatur gestützt, die Telozyten perivaskulär lokalisieren, wobei ihre Telopoden in den peribronchialen und alveolären Raum hineinreichen. Sie exprimieren Oct4, Vimentin, Sca-1, PDGFR-beta, C-kit und VEGF. Diese Resultate konnten in der Lunge adulter Wildtypmäuse mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie durch Immunofluoreszenz bestätigt werden. Durch die Analyse mittels Durchflusszytometrie konnte auf der Basis von Oct4-GFP Reportermäusen eine Population von Oct4-GFP+ Zellen identifiziert werden. Diese Zellen wurden isoliert und kultiviert und zeigten ein charakteristisches Wachstum mit langen Extensionen wie bei Telozyten. Laser-Mikrodissektion und qRT-PCR wurden etabliert um die Immunofluoreszenzdaten auf mRNA Ebene zu bestätigen. Da die Daten die Hypothese unterstreichen, dass es sich bei den Oct4+ Zellen um Telozyten handelt, ist das nächste Ziel, die Rolle der Telozyten in der adulten Mauslunge zu untersuchen und die Rolle von Oct4 in diesen Zellen zu ermitteln.