Gleichzeitige Fluoreszenz-Markierung multipler Zelltypen zur Untersuchung der Lungenentwicklung und -regeneration

Abstract

Die Erforschung der molekularen Mechanismen und zellulären Zusammenhänge von entwicklungsbiologischen und pathologischen Prozessen sind in den letzten Jahrzehnten immer weiter in den Fokus wissenschaftlicher Untersuchungen gerückt. Gerade in schwerwiegenden, weit verbreiteten und mit einer schlechten Prognose verbundenen Krankheitsbildern hat die Forschung zum Ziel, nicht nur die Symptomatik der Erkrankungen zu mildern, sondern über das Wissen der pathologischen Veränderungen eventuell reversible Mechanismen zu finden und zu aktivieren. Bei der Problematik schwerer Lungenerkrankungen wie der COPD, fibrotischer Krankheitsbilder und der PH sind es die Komplexität der Erkrankungen, die individuelle Ausprägung verschiedener Symptomatik, unbekannte Ursachen und teilweise überlappende Teilaspekte (Fibrose), die Definitionen oder klinische Klassifizierungen der Krankheitsbilder erschweren. Die Erforschung der molekularen Grundlagen der Erkrankungen verdeutlicht diese Problematik einmal mehr, da verschiedenste Zellinteraktionen, (Trans)-Differenzierungen, Proliferation und Apoptose, meist weiträumig unter dem Begriff Remodeling zusammengefasst, in unterschiedlichen Zelltypen auf engstem Raum stattfinden und beschrieben werden, jedoch die Ursachen sowie die zu Grunde liegenden Mechanismen kaum klar definiert werden können. Ein erster Ansatz, dieser Problematik zu begegnen kann daher sein, einzelne, voneinander abgrenzbare pathologische Prinzipien des Remodeling (z. B. bestimmte Veränderungen des zellulären Programms) für die Markierung, Identifizierung, Vereinzelung und molekularen Charakterisierung von Zelltypen zu nutzen, die in die Erkrankungsprozesse involviert sind. Hierbei sind die in den letzten Jahrzehnten gemachten Fortschritte im Lineage Tracing, inklusive der genetischen Manipulation und Herstellung transgener Organismen von Nutzen, die das Wissen um molekulare/zelluläre Veränderungen mit Reportergen-Techniken verknüpfen und Remodeling-Prozesse sichtbar machen. Die in dieser Arbeit vorgestellten Projekte sollten durch die Weiterentwicklung bestehender transgener Techniken einen Beitrag zu der oben genannten Problematik leisten. Hierbei verfolgten die drei Projekte unterschiedliche Zielsetzungen. LungGlow 1 war ein Projekt, das vor allem die Interaktion von Epithelium und Mesenchym und den quantitativen Nachweis der pathologischen Veränderungen parallel in den betroffenen Zelltypen aufzeigen sollte. Das letztendliche Ziel hierbei lag auf der Untersuchung der Erscheinungsformen der COPD, bei der die zu detektierenden Zelltypen in besonderem Maße von Remodeling-Prozessen betroffen waren. Das Scheitern dieses Projektes ist in diesem Fall wahrscheinlich auf die Unwägbarkeiten der gewählten Methode zurückzuführen, ein bedauerlicher Aspekt, von dem in letzter Konsequenz jedoch das LungGlow 2 Projekt profitieren konnte. HSV-TK, das Projekt zur gezielten Deletion von Fibrozyten, wurde in dieser Arbeit nur anfänglich bezüglich der in vitro Funktionalität begleitet. Die weiterführenden, in dieser Arbeit nicht mehr thematisierten experimentellen Ausführungen hinsichtlich der Rolle des untersuchten Zelltyps in der experimentellen pulmonalen Hypertonie zeigten jedoch, dass durch die gezielte Entfernung die Symptome und zelluläre Veränderungen dieser Erkrankung vermindert werden. Diese Aspekte machen die Fibrozyten zu einem Kandidaten für weitere Untersuchungen, auch in Bezug auf eventuelle Interaktionen mit anderen Zelltypen oder Differenzierungs-Prozesse im Zielgewebe der Lunge. Das LungGlow 2 Projekt stellte eine Weiterentwicklung zu LungGlow 1 und eine Parallelentwicklung zum HSV-TK Projekt dar und ist dennoch als eigenständig in Aufbau und Zielsetzung zu betrachten. Das statische Modell, das das LungGlow 1 Projekt noch darstellte, wurde weiterentwickelt zu Gunsten eines dynamischen, durch Induzierbarkeit kontrolliert einsetzbaren und nur durch die Wahl entsprechend zu verpaarender Mauslinien begrenzten Systems zur direkten Fluoreszenzmarkierung definierter Zelltypen und eventuell von ihnen ausgehender (Trans)Differenzierungs- und Remodeling-Prozesse. Mit der in vivo Übertragung des bisher in vitro erfolgreich getesteten Systems können im Zuge zukünftiger Arbeiten unterschiedliche wissenschaftliche Fragestellungen untersucht werden, die durch die bisherigen Modelle des HSV-TK bezüglich der PH und insbesondere des LungGlow 1 Projektes nicht beantwortet werden konnten. Over the past decades, research into the molecular mechanisms of developmental and pathological processes has intensified. In particular in the case of severe disease accompanied by poor prognosis, the aims of this research is not only to alleviate symptoms, but also through improved knowledge about the pathomechanisms at play to manage or cure the disease by activating mechanisms that reverse the disease process. The problems encountered with the management and treatment of severe lung diseases, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), fibrotic diseases and pulmonary arterial hypertension (PAH), include disease complexity, inter-patient variation in terms of symptoms, severity, and aetiology and overlapping pathology (such as fibrosis). Central to lung disease pathophysiology is tissue remodelling, which encompasses cell differentiation, apoptosis, proliferation, and intercellular communication. However, the signals that guide these processes during tissue remodelling are currently not delineated. Further research into the pathomechanisms of lung disease must focus on identifying single, definable pathways of tissue remodelling. This will be facilitated by marking, identifying and characterizing cell types relevant to the disease process. Lineage tracing, which has been developed as a methodology over the past decades, and which includes the genetic manipulation and generation of transgenic animals, can be used to combine the knowledge of molecular and cellular changes with reporter gene techniques to visualize these remodelling processes. In this thesis three projects have been introduced, using transgenic approaches, to address these issues. The first of these projects, named LungGlow 1 was designed for the visualization of interactions between the epithelium and mesenchyme, for the quantitative analysis of pathological changes in parallel, in the affected cell types. Substantial technical problems were encountered during the development of this project, most notably, that the lack of inducibility of the system, as well as the random integration of the constructs, which yielded reporter mice where the expression levels of reporter genes could not be controlled. Ultimately, the further development of LungGlow 1 was abandoned; however, the knowledge gleaned was instrumental in the initiation of LungGlow 2, described further below. The second of these projects, named HSV-TK , was a project that facilitated the deletion of fibrocytes in vivo. Only part of the full HSV-TK project is covered here, as this represents a split project undertaken by multiple investigators. The aspects of the HSV-TK project undertaken personally by the candidate included that validation of the inducibility of the transgene, since this knowledge had been acquired by the applicant during the LungGlow 1 project.The third and final project presented in this dissertation is LungGlow 2, which represents an advance over the abandoned LungGlow 1 project. In LungGlow 2, a directed, forced integration approach was applied, and an element of inducibility was applied to the methodological approach. If further developed, LungGlow2 represents a highly dynamic, inducible and controllable system for the direct labelling of defined cell-types to study transdifferentiation and remodelling processes operative during lung development and disease.