Identification and characterization of specific amino acid residues in the NS1 protein that facilitated viral replication of avian influenza viruses in mammalian host

Abstract

Recently, it was shown that the NS-segment of the avian influenza virus strain A/Goose/Guangdong/1/1996 (GD, H5N1) promotes replication and increases pathogenicity of the strictly avian strain A/FPV/Rostock/34 (FPV, H7N1) in mammalian cells and mice, whereas the NS-segment of A/Mallard/NL/12/2000 (MA, H7N3) impaired FPV replication in mammalian cells. The NS1 proteins of GD and Ma differ only by eight amino acids. Nevertheless, the critical genetic differences were not yet identified. In this report, I demonstrate that the specific amino acid changes D74N and/or P3S+R41K+D74N in the NS1-MA protein are sufficient to allow mammalian adaption of avian influenza viruses. They lead to enhanced virus propagation in mammalian cells and increased plaque size, suggesting shorter replication cycles. On a molecular level, I show the importance of these specific residues for strongly enhanced mRNA production as well as viral protein production in mammalian cells. At the same time this adaptive changes are not disadvantageous in avian cells. My study suggests that the D74N and/or P3S+R41K+D74N substitutions are involved in the temperature adaptation of the polymerase of avian influenza virus from birds to mammals. They also confer the ability to the otherwise strictly avian influenza virus to replicate in mice and cause disease. Global gene expression of mammalian A549 cells upon infection with FPV harboring NS-MA (FPV-NSMA) or with FPV harboring NS-MA mutants (FPV-NSMA_D74N and FPV-NSMA_ P3S+R41K+D74N) viruses are qualitatively similar in the activation of biological host inflammatory response including type I interferon (IFN) and chemokine signaling, However, in comparison to FPV-NSMA virus infected cells, the mutants NS1-MAD74N and/or NS1-MAP3S+R41K+D74N elicit a quantitatively weaker host inflammatory response of type I interferon (IFN) and pro-inflammatory cytokine/chemokine response. This points to a reduced innate immune response, which is correlated with increased viral replication competence. Together, these adaptive mutations in the NS1 protein seem to allow to establish successful infections in mammalian cells. Vor kurzem konnten wir zeigen, dass das NS-Segment des Influenza-Virus A/Goose/Guangdong/1/1996 (GD, H5N1) sowohl die Replikation von A/FPV/Rostock/34 (FPV, H7N3) in Säugerzellen und Mäusen begünstigt wie auch dessen Pathogenität in eben diesen erhöht. Im Gegensatz dazu beeinflusst das NS-Segment von A/Mallard/NL/12/2000 (MA, H7N3) die FPV Replikation in Säugerzellen negativ. Die NS1-Proteine von GD und MA unterscheiden sich in nur acht Aminosäuren. Jedoch wurden bisher die verantwortlichen Aminosäuren für diesen funktionellen Unterschied nicht identifiziert. In dieser Arbeit zeige ich, dass die spezifischen Aminosäure-Änderungen D74N und/oder P3S+R41K+D74N im NS1-MA Protein ausreichen, um eine Adaption des Virus an Säugerzellen zu ermöglichen. So führen sie zu einer gesteigerten Virus-Replikation und größeren Plaques in Säugerzellen, was einen kürzeren Replikationszyklus nahe legt. Auf molekularer Ebene zeige ich, dass diese Aminosäure-Änderungen zu einer stark vermehrten mRNA Produktion wie auch zu einer gesteigerten Protein-Synthese in Säugerzellen führen, während diese Adaptionen jedoch keine Replikations-Nachteile in Vogelzellen zeigen. Meine Studie zeigt auch, dass die Mutationen D74N und/oder P3S+R41K+D74N eine Rolle in der Temperatur-Adaption der Polymerasen von Vogelgrippe-Viren an Säuger spielen. Außerdem ermöglichen sie originär strikt aviären Vogelgrippe-Viren, sich in Mäusen zu vermehren und sie erkranken zu lassen. Die Gesamtgenexpression in infizierten Säugerzellen ist zwischen Wildtyp und mutiertem Virus qualitativ ähnlich, insbesondere im Hinblick auf die fast identischen Immunantworten durch Typ1 Interferon (IFN) und Cytokine/Chemokine. Eine Infektion von FPV, welches das NS1-MA mit den Mutationen D74N und/oder P3S+R41K+D74N besitzt, löst aber im Vergleich zum NS1-MA Wildtyp eine quantitativ schwächere Immunantwort insbesondere bezogen auf Typ1 Interferon (IFN) und pro-entzündliche Cytokine/Chemokine aus. Dies ist ein Hinweis auf eine wahrscheinlich weniger starke humorale Immunantwort, die mit einer verbesserten Virus-Replikation einhergeht. Zusammengefasst erlauben o.g. adaptive Mutationen des NS1-Proteins es, aviären Influenza-Viren eine erfolgreiche Infektion in Säugerzellen zu etablieren.