On Slide Selektion auf Formalin-fixiertem und in Paraffin-eingebettetem (FFPE) Patientengewebe zur Generierung spezifischer Antikörper mittels Phage Display Technologie

Abstract

Monoklonale Antikörper nehmen in der Diagnose und zielgerichteten Therapie von malignen Erkrankungen eine immer wichtigere Rolle ein. Die erfolgreichste in vitro Methode zur Generierung neuer, monoklonaler Antikörper ist die Phage Display Technologie. Hierbei werden aus einem Pool von an Bakteriophagen gekoppelten Antikörpern Antigen-spezifische Antikörper selektioniert. Beim Standardselektionsverfahren werden rekombinante Proteine, Antigen-transfizierte Zellen oder Tumorzelllinien als Zielantigene verwendet. Diese Antigene können sich jedoch von der natürlichen Form der Antigene in den Tumoren der Patienten unterscheiden, wodurch es zur Selektion von klinisch irrelevanten Antikörpern kommen kann. Aus diesem Grund wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Antikörperselektionsstrategie auf Formalin-fixiertem und in Paraffin-eingebettetem (FFPE) Patienten Routinematerial mit komplexen Antigenstrukturen etabliert. FFPE Biopsien erhalten größtenteils ihre tumorspezifischen Charakteristika, weshalb sie als ein vielversprechendes Ausgangsmaterial für die Selektion krankheitsrelevanter Antikörper erscheinen. Da es sich bei dem verwendeten Patientenmaterial um Routinebiopsate handelt, entsteht keine zusätzliche Belastung für den Patienten. Außerdem ist im Vergleich zum Standardselektionsverfahren keine aufwendige Herstellung, Aufreinigung, Lagerung oder Kultivierung des Ausgangsmaterials notwendig.Die Etablierung der Methode erfolgte auf immobilisierten Gewebeschnitten von vier verschiedenen Patientenbiopsaten mit kleinzelligem Bronchialkarzinom (SCLC). Die kommerziellen, humanen scFv Antikörperbibliotheken Tomlinson I und J wurden zunächst auf gesundem Lungengewebe depletiert, um so tumorirrelevante Antikörper zu entfernen. Anschließend erfolgte die Selektion auf SCLC-Gewebeschnitten. Zur Erhöhung der Epitopzugänglichkeit wurden vor der Depletion und Selektion verschiedene Antigendemaskierungsverfahren angewendet. Hierdurch konnte eine Serie von neuen Antikörpern selektioniert werden, deren Tumorspezifität in vitro im ELISA und in der Durchflusszytometrie auf den SCLC Zelllinien NCI-H69, NCI-H82 und DMS 273 verifiziert werden konnte. Bei der näheren Charakterisierung von drei der selektionierten Antikörper konnte zusätzlich die spezifische Bindung ex vivo auf Tissue Microarrays mit 35 verschiedenen SCLC Biopsien im Vergleich zu 20 verschiedenen gesunden Organen bestätigt werden. Nach Analyse des Internalisierungsverhaltens der drei scFv s, wurden diese zur Herstellung von rekombinanten Immuntoxinen an eine verkürzte Form des Pseudomonas Exotoxins A (ETA´) fusioniert. Das zytotoxische Potenzial von zwei der drei rekombinanten Immuntoxine konnte durch Zellviabilitäts- (XTT) und Apoptose-Assays (Annexin V) verifiziert werden, wobei die mittlere inhibitorische Dosis (IC50) im unteren nanomolaren Bereich lag. Somit konnte ein möglicher diagnostischer und therapeutischer Einsatz der selektionierten Antikörper bestätigt werden.Bei der On Slide Selektion handelt es sich um die erste, Phage Display basierte Antikörperselektion direkt auf Patienten FFPE Routinematerial, welches auf Glasobjektträgern immobilisiert wurde und dessen komplexe Antigenstrukturen durch verschiedene Demaskierungsverfahren freigelegt wurden. Monoclonal antibodies play a major role in diagnostic and targeted therapy of malignant disease. The most successful in vitro method for generation of new monoclonal antibodies is the phage display technology, in which an antigen specific antibody can be selected from a pool of antibody bearing phage particles. Standard phage display panning uses purified proteins, antigen-transfected cells or tumor cell lines as target antigen. However, these antigens may differ from the antigens in malignant tumors in patients, thus selection of clinically-irrelevant antibodies is not uncommon. In this study an antibody selection strategy on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) patient routine material with complex antigenic structures has been established. FFPE biopsies mainly preserve their tumor-specific characteristics and therefore seem to be a much more reliable material for the selection of clinically relevant antibodies. Because biopsies are taken routinely for diagnosis, there is no additional stress for the patient. In addition, there is no need for laborious production, purification, storage or cultivation of the starting material.The establishment of the method was achieved on immobilized tissue sections of four different patient biopsies with small cell lung cancer (SCLC). The commercial human scFv antibody libraries Tomlinson I and J were depleted on normal lung tissue to subtract tumor-irrelevant antibodies. Afterwards selection was performed on SCLC tissue slides. To enhance antigen accessibility different epitope retrieval procedures were applied before depletion and selection. A series of novel antibodies was isolated and their tumor-specificity was confirmed in vitro by ELISA and by flow cytometry using the SCLC cell lines NCI-H69, NCI-H82 and DMS 273. Further characterization of three selected antibodies additionally revealed specific binding on tissue microarrays containing 35 different SCLC samples and 20 types of normal organs ex vivo. We monitored the internalization of these three selected scFv antibodies and fused them with Pseudomonas exotoxin A (ETA´) to produce recombinant immunotoxins. The cytotoxic potential of two of the three recombinant immunotoxins was verified by cell viability (XTT) and apoptosis assays (Annexin V), achieving half maximal inhibitory concentration (IC50) values in low nanomolar range. Thus, a potential diagnostic and therapeutic application of the selected antibodies was confirmed.The described On Slide Selection is the first phage display based antibody selection directly on patient FFPE routine material immobilized on glass slides in which the complex antigen structures were revealed with different epitope retrieval techniques.