Separate Betrachtung der beiden miR-122-Bindungsstellen in der Hepatitis C Virus 5´-UTR im Hinblick auf die Translationsstimulation und RNA-Stabilität

Abstract

Das Hepatitis C Virus (HCV) gehört zur Familie der Flaviviridae und besitzt ein einzelsträngiges RNA-Genom mit positiver Polarität. Das Genom setzt sich aus einem offenen Leserahmen (ORF), kodierend für ein Polyprotein, sowie zwei strukturreichen untranslatierten Regionen (UTRs) zusammen. Die 5´- und 3´-UTR flankieren den ORF und sind an der Regulation der viralen Translation und Replikation entscheidend beteiligt. Die internal ribosome entry site (IRES) in der HCV-5´-UTR ist dabei unerlässlich für die Translationsinitiation. Darüber hinaus befinden sich zwei konservierte microRNA-122- (miR-122-) Bindungsstellen am Anfang der 5´-UTR. Es wurde bereits nachgewiesen, dass diese Bindung die HCV-RNA-Replikation und -Translation sowie die Stabilität der viralen RNA erhöht.Im Vordergrund dieser Arbeit stand die Charakterisierung der individuellen Funktionen beider miR-122-Zielsequenzen im HCV-Replikationszyklus. Dafür wurden die Erkennungssequenzen so mutiert, dass sie über artifizielle miRNAs separat adressiert werden konnten. Zur Untersuchung der spezifischen Bindung der modifizierten miRNAs an die mutierten Zielsequenzen der HCV-5´-UTR wurde zunächst eine anti-Argonaute 2- (Ago2-) RNA-co-Immunpräzipitation (co-IP) durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die miR-122-Erkennungssequenzen separat adressiert werden können und dass nach gemeinsamer Hybridisierung die Bindung beider miRNA/Ago2-Komplexe kooperativ erfolgt. Die Hypothese einer Überkreuz-Bindung der miR-122, bei der die Sequenzen beider Bindungsstellen von einem miR-122-Molekül adressiert werden können, konnte nicht bestätigt werden.Durch die Verwendung eines HCV-Reporter-Systems mit der HCV-5´-UTR, einem Luciferase-Gen und der viralen 3´-UTR konnte eine kooperative Stimulation der Translation festgestellt werden. Sowohl im Bindungs- als auch im Translationsassay konnte ein stärkerer Effekt der Hybridisierung der miRNA an die erste Bindungsstelle als an die Zweite nachgewiesen werden. Die in vitro-Studien zeigten hingegen eine deutlich stärkere Affinität der miR-122 an die zweite Bindungsstelle. Somit ist anzunehmen, dass in vivo die Affinität der Bindung der miR-122 an die virale RNA durch Proteine im miRNA-Protein- (miRNP-) Komplex und durch Strukturen der HCV-IRES beeinflusst wird.Darüber hinaus wurde die Gesamt-RNA-Stabilität und die Integrität des 5´-Endes der HCV-Reporter-RNAs untersucht. Überraschenderweise konnte kein miR-122-abhängiger Effekt nach separater oder gemeinsamer Adressierung der Erkennungssequenzen auf die Stabilität oder Integrität der HCV-5´-UTR-RNA bis zu 36 h nach Elektroporation nachgewiesen werden. Da jedoch frühere Studien mit kompletten HCV-Genomen einen Effekt der miR-122 auf die HCV-RNA-Stabilität gezeigt haben, ist zu vermuten, dass Bestandteile des HCV-Genoms an der Stabilitätskontrolle der viralen RNA beteiligt sind.