Optimizing DNA double strand break repair for homologous recombination based gene therapy

Abstract

The CRISPR-Cas technology enables rapid and precise genome editing at any desired genomic position in almost all cells and organisms. For therapeutic application, it is crucial to bias repair outcomes towards high fidelity homology directed repair (HDR) and to avoid error prone nonhomologous end-joining (NHEJ). In this study, the impact of different repair templates on the frequency of homology directed repair (HDR) and non-homologous end-joining (NHEJ) has been analyzed.A stable HEK293 cell line expressing TLR3 was used to quantify HDR and NHEJ events. The modified TLR system (TLR3) comprises a bicistronic expression system of a non-functional green fluorescent protein (GFP) gene, followed by a self-cleaving T2A peptide and a second blue fluorescent protein (BFP) gene in a reading frame shifted by 2 bp. A stable HEK293 cell line expressing TLR3 was generated by transfecting a linearized pcDNA3.1(-)-TLR3 plasmid followed by neomycin selection. Donor templates of 1000 bp length containing the corrected GFP sequence were generated as circular plasmid, linearized plasmid with long 3 or 5 backbone overhang, or as PCR product. The sequence to be corrected was either centrally located (RS55), with a shorter 5 homologous region (RS37), or a shorter 3 homologous region (RS73). Six different CRISPR-Cas9 target sites were identified upstream or downstream of the stop codon within the GFP sequence containing the initiating 5 G and the 3 PAM (NGG).DNA repair activity was measured by FACS.Guide RNAs targeting the active strand (T5, T7) showed higher NHEJ frequencies compared to guide RNAs targeting the inactive strand. HDR activity was highest when using the linearized plasmid with the short 5 backbone overhang and the RS37 design, followed by the PCR product or the linearized plasmid with the long 5 backbone overhang, both with RS73 design. Circular plasmid was least efficient in generating HDR events.The effect of the different repair templates on NHEJ frequencies was marginal. The results demonstrate the importance of the design of theguide RNA and template DNA on the frequency of DNA repair events and thus, ultimately on the outcome of treatment approach using HDR. Durch die CRISPR-Cas Technologie ist es möglich, schnelle und genaue Veränderungen in jeder gewünschten Gensequenz, in nahezu jedem Zelltyp und Organismus durchzuführen. Wird die Technologie zu Therapiezwecken genutzt, ist es wichtig, die Ergebnisse der Reparatur in Richtung HDR zu lenken und das fehlerhafte NHEJ zu vermeiden. In dieser Studie wurde der Einfluss verschiedener Reparatur-Templates auf die HDR- und NHEJ-Rate analysiert.Eine stabile HEK293 Zelllinie, die das TLR3 exprimiert, wurde verwendet um die HDR und NHEJ Events zu quantifizieren. Das modifizierte TLR System (TLR3) beinhaltet ein bicistronisches Expressionssystem. Dieses besteht aus einem nicht funktionellen GFP-Gen (grünes Fluoreszenz Protein), gefolgt von einem selbst spaltenden T2A Peptid und einem BFP-Gen (blaues Fluoreszenz Protein) in einem Leserahmen, der um zwei Basenpaare verschoben ist. Eine stabile HEK293 Zelllinie, die das TLR3 exprimiert, wurde durch Transfektion des linearisierten pcDNA3.1(-)-TLR3 Plasmids mit anschließender Neomycin Selektion generiert. Die Donor-Templates mit 1000 Basenpaaren Länge, die die korrigierte GFP Sequenz beinhalten, wurden in Form des zirkulären Plasmids, des linearisierten Plasmids mit langem 3 oder 5 Backbone Überhang, oder des PCR Produkts verwendet. Die zu korrigierende Sequenz liegt entweder zentral (RS55), besitzt eine kürzere 5 homologe Region (RS37), oder eine kürzere 3 homologe Region (RS73). Sechs verschiedene CRISPR-Cas9 targetsites wurden upstream oder downstream des Stopp-Codons innerhalb der GFP Sequenz, die das initiale 5 G und die 3 PAM (NGG) beinhaltet, identifiziert. Die DNA Reparaturaktivität wurde durch FACS gemessen.Die Guide RNAs, die den aktiven Strang adressieren (T5, T7), zeigen eine höhere NHEJ Rate im Vergleich zu den guide RNAs, die den inaktiven Strang adressieren. Die höchste HDR Aktivität konnte mit Hilfe des linearisierten Plasmids mit kurzem 5 Backbone Überhang und RS37 Design erzielt werden, gefolgt von dem PCR Produkt oder dem linearisierten Plasmid mit langem 5 Backbone Überhang, beide mit RS73 Design. Das zirkuläre Plasmid erzeugte am wenigstenHDR Events. Der Effekt der verschiedenen Reparatur-Templates auf die NHEJ Rate ist marginal. Die Ergebnisse zeigen den Einfluss des Designs der guide RNA und der Template DNA auf die Rate der DNA Reparatur-Events und damit letztlich auf den Erfolg des Therapie-Ansatzes durch das Nutzen von HDR.