Expression, purification and crystallization of phyB and characterization of putative PIF1 from Sorghum bicolor

Abstract

The main aim of this study was to investigate the structural differences between the photosensory modules of plant phytochromes and cyanobacterial phytochromes. To this end, three constructs of Sb.phyB, namely NPGP, PGP and PG, were successfully cloned, produced, purified and crystallized. Unlike prokaryotic phytochromes such as Cph1, obtaining diffraction-quality crystals for plant phytochromes is extremely challenging, indeed, no structure for a complete phyB photosensory module has been published to date. In this study, however, it proved possible to generate both NPGP and PGP crystals diffracting to 6 Å. PG crystals diffracting to atomic resolution were also generated and a complete dataset was collected, albeit with some anomalous pattern. SER mutation and additive screening efforts were also completed to mitigate difficult crystal morphology and improve the diffraction quality of NPGP and PG crystals. Additional work is still required to solve the structure of these fragments. Das Hauptziel dieser Studie war es, die strukturellen Unterschiede zwischen den Photosensormodulen von Pflanzenphytochromen und cyanobakteriellen Phytochromen zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden drei Konstrukte von Sb.phyB, nämlich NPGP, PGP und PG, erfolgreich kloniert, produziert, gereinigt und kristallisiert. Im Gegensatz zu prokaryotischen Phytochromen wie Cph1 ist das Erhalten von Beugungsqualitätskristallen für Pflanzenphytochrome äußerst anspruchsvoll, in der Tat wurde bisher keine Struktur für ein komplettes phyB-Photosensor-Modul veröffentlicht. In dieser Studie war es jedoch möglich, sowohl NPGP- als auch PGP-Kristalle zu erzeugen, die auf 6 Å beugten. PG-Kristalle, die zur atomaren Auflösung beugten, wurden ebenfalls erzeugt und ein vollständiger Datensatz wurde gesammelt, allerdings mit einigen anomalen Mustern. SER-Mutation und Additiv-Screening-Bemühungen wurden ebenfalls abgeschlossen, um eine schwierige Kristallmorphologie zu mildern und die Beugungsqualität von NPGP- und PG-Kristallen zu verbessern. Zusätzliche Arbeit ist noch erforderlich, um die Struktur dieser Fragmente zu lösen.